PLAG1在結直腸癌中的表達及臨床意義

曹路路，吳書勝，閆 瀅，柯麗紅，羅會芹，陳文菊，胡小秀，李慧敏，牛佳郁，李夢鴿，徐惠君，何義富

根據世界衛生組織國際癌癥研究機構報道，2020年全世界結直腸癌(CRC)新發病例約193萬例，死亡約93.5萬例[1]。盡管CRC的治療方法在不斷改善，但CRC患者的5年生存率仍然很低[2-4]。CRC預后不佳的最關鍵原因之一是缺乏有效的早期診斷方法[5-6]。大多數患者確診時已屬晚期，無法進行根治性手術。有明確的證據表明，篩查可將CRC發病率和病死率降低30%～60%[7]。此外，盡管手術技術不斷進步成熟，但術后復發仍然是臨床的難點，因此,尋找能提高診斷率、指導預后的分子靶標是研究熱點。

多形性腺瘤基因1(PLAG1)位于人類染色體8q12，屬于多形性腺瘤(PLA)基因家族成員之一，大小為7313 bp，包含5個外顯子，4個內顯子，編碼序列為481～1983 nt。PLAG1編碼一種具有2個假定的核定位信號的鋅指蛋白，由501個氨基酸組成[8]。PLAG1相關基因本體注釋包括DNA結合轉錄因子活性和轉錄激活因子活性。既往研究表明，PLAG1過表達在軟組織腫瘤發生和發展中起到了重要作用[9-10]。近年來，越來越多的研究表明PLAG1是一種促癌因子，如PLAG1為肝細胞肝癌的獨立預后因素[11]、PLAG1的敲低能夠抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移、侵襲及增加卵巢癌細胞化療敏感性[12]。然而，在不同腫瘤中PLAG1的作用也不完全相同[13]。PLAG1被認為與多種惡性腫瘤的發生、發展和侵襲密切相關。然而，PLAG1在CRC發生發展和預后中的作用仍然不明確。鑒于該領域缺乏足夠的研究，我們的研究通過免疫組織化學檢測80例CRC患者癌組織和相應癌旁組織中PLAG1的表達情況，并分析了PLAG1的表達與CRC患者臨床病理特征和預后的關系。

1 資料和方法

1.1臨床資料和組織標本 收集2014年1月—2017年3月中國科學技術大學附屬第一醫院西區 安徽省腫瘤醫院外科手術切除的CRC患者石蠟標本進行免疫組織化學分析，癌組織和配對癌旁組織(距癌組織≥5 cm)各80例。納入標準:均接受根治性手術治療，術前無抗腫瘤治療史，且組織病理學檢查證實為結直腸腺癌;年齡≥18歲;病例資料完整：包括完整的臨床病理數據，如年齡、性別、腫瘤分期和分化程度。排除標準:嚴重的心肝腎功能異常;合并其他部位腫瘤;家族性腺瘤性息肉病或Lynch綜合征。根據AJCC第八版進行術后病理分期。根據NCCN指南行術后輔助治療。采用電話或門診復查隨訪獲得生存資料，隨訪截止時間為2022年1月1日，最終獲得60例的隨訪資料。此外，總生存期(OS)定義為手術日期至死亡的時間。無病生存時間(DFS)定義為手術日期至首次明確診斷腫瘤復發或死亡之間的時間。本研究獲得了中國科學技術大學附屬第一醫院西區 安徽省腫瘤醫院倫理委員會的批準同意。

1.2免疫組織化學染色 將石蠟包埋的標本切成4 μm厚的切片，將病理切片置于60 ℃的組織干燥箱中60 min。然后切片用二甲苯脫蠟并依次通過梯度乙醇水化，將載玻片在0.01 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)中于100 ℃蒸煮20 min，然后從熱源中取出并在緩沖溶液中于室溫冷卻以進行抗原修復。切片與0.3%過氧化氫一起孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶的活性。將組織載玻片與兔抗人PLAG1多克隆抗體以1∶200的稀釋度在4 ℃下孵育過夜，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。并與辣根過氧化物酶耦聯的二抗(中杉金橋生物技術，北京，中國)孵育30 min。使用3,3'-二氨基聯苯胺(DAB)顯色，用蘇木精復染細胞核，在梯度乙醇中脫水并用中性膠密封。PLAG1表達的免疫反應強度由2名病理科醫師獨立評估。我們使用既往文獻發表的方法來評估PLAG1的半定量表達，公式如下：免疫反應性評分=染色強度評分×陽性細胞評分的比例。染色強度評分定義為0分(陰性)、1分(弱強度)、2分(中等強度)和3分(強強度)。陽性細胞評分比例定義為0分(無染色)、1分(<25%)、2分(25%～50%)、3分(50%～75%)和4分(≥75%)。切片免疫反應評分≥6分定義為高表達，否則定義為低表達。

1.3生存預后分析 使用GEPIA2數據庫(www.gepia2.cancer-pku.cn)分析PLAG1表達與CRC患者OS和DFS間的相關性。操作步驟:輸入基因名稱PLAG1，點擊生存分析頁面，選擇OS/DFS;選擇腫瘤類型CRC(同時選取COAD和READ);點擊plot可視化分析。GEPIA2使用Log-rank法進行假設檢驗。上述線上數據庫檢索分析時間截至2022年4月27日。將最終獲得隨訪資料的60例CRC根據免疫組織化學PLAG1表達水平評分高低分為2組，使用SPSS 22.0作生存分析并繪制Kaplan-Meier生存曲線。并且將60例CRC的生存信息通過單因素和多因素Cox比例風險回歸模型分析CRC預后相關的危險因素。

1.4基因集富集分析 使用LinkedOmics數據庫(http://www.linkedomics.org/admin.php)LinkInterpreter模塊進行PLAG1 KEGG聚類分析。具體操作步驟，腫瘤類型:選擇CRC;數據類型:選擇RNAseq;數據屬性:選擇PLAG1;靶數據類型:選擇RNAseq;統計學方法:選擇Spearman相關性分析;導出數據:導出CRC中與PLAG1表達顯著相關的前1000位基因;分析:使用DAVID網站進行KEGG聚類分析。

1.5觀察指標 ①PLAG1在癌組織和配對癌旁組織中的表達情況；②PLAG1表達與CRC患者臨床病理特征的關系；③PLAG1表達與CRC患者預后；④PLAG1在CRC發生發展中可能涉及的分子機制。

2 結果

2.1PLAG1在CRC組織中表達上調 本組80例癌組織和對應癌旁組織免疫組織化學結果顯示，PLAG1的陽性表達主要見于CRC組織細胞質中(圖1)。CRC組織中PLAG1陽性表達率高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

圖1 PLAG1在癌旁組織陰性表達及CRC組織陽性表達情況(HE)

表1 PLAG1蛋白在CRC組織及癌旁組織中的表達情況[例(%)]

2.2CRC組織中PLAG1的表達與T分期和N分期、臨床病理分期的關系 PLAG1在CRC組織中的表達與T分期和N分期、臨床病理分期密切相關(P<0.05)。但PLAG1水平與年齡、性別、腫瘤類型、腫瘤分化程度間無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 PLAG1表達與CRC臨床病理特征關系[例(%)]

2.3PLAG1高表達與CRC患者預后關系及預后影響因素 GEPIA2數據庫分析結果顯示，PLAG1高表達組CRC患者的OS短于PLAG1低表達組[P=0.0052；HR=1.9，P(HR)=0.0059]。見圖2a。PLAG1高表達組的DFS短于PLAG1低表達組[P=0.0070；HR=1.8，P(HR)=0.0078]。見圖2b。為了對生存分析數據進行驗證，我們進一步通過最終獲得隨訪資料的60例患者的預后數據分析了PLAG1的表達與CRC患者預后的關系。采用Log-rank法進行生存分析，結果顯示PLAG1高表達的患者OS和DFS短于PLAG1低表達患者(P<0.05)。見圖2c、2d。單因素分析表明，PLAG1表達、N分期和臨床病理分期與CRC患者的OS和DFS相關(P<0.05)。見表3。多因素分析顯示，PLAG1表達、N分期和臨床病理分期是CRC患者術后OS和DFS的獨立危險因素(P<0.05,P<0.01)。見表4。

圖2 PLAG1與CRC患者預后的關系

表3 CRC術后OS和DFS影響因素的單因素分析

表4 CRC術后OS和DFS影響因素的Cox比例風險回歸模型分析

2.4PLAG1在CRC發生發展中可能涉及的分子機制 使用Linkedomics數據庫LinkInterpreter模塊導出PLAG1在CRC中的KEGG通路富集結果，分析PLAG1在CRC發生發展中的分子功能以及相關分子機制。KEGG通路富集分析結果顯示，PLAG1基因可能參與調節WNT、Hedgehog、Notch、Hippo、mTOR、PI3K-Akt等多種信號通路。見圖3。

圖3 PLAG1在CRC中的功能基因集KEGG通路富集分析PLAG1為多形性腺瘤基因1，CRC為結直腸癌

3 討論

PLAG1屬鋅指蛋白家族中的一員，研究發現其在多種腫瘤如腮腺多形性腺瘤、脂母細胞瘤、間質細胞瘤等中異常表達[14-15]。體外實驗證實，PLAG1具有促進NIH-3T3細胞增殖、非錨定依賴性生長和使裸鼠成瘤的活性[16]。然而，PLAG1在CRC中的表達和臨床意義仍不確定。

本研究通過免疫組織化學檢測發現，PLAG1在CRC中的表達水平高于相應的癌旁組織。CRC患者中PLAG1的高表達與不良臨床特征顯著相關，包括T分期、N分期和臨床病理分期。我們的研究結果表明，PLAG1在CRC組織中的表達上調，其高表達可能與腫瘤生長和轉移有關，PLAG可能參與CRC的發生與進展。遺憾的是，我們未能在本研究中詳細闡述PLAG1在CRC發生和發展中的分子機制。我們通過生物信息學分析推測PLAG1可能參與調節WNT、Hedgehog、Notch、Hippo、mTOR、PI3K-Akt等多種信號通路，亦有研究報道,PLAG1在卵巢癌中參與IGF信號通路調控[12]，在肺癌中參與CamKK2-AMPK信號通路調控[17]，在CRC中的具體分子機制有待進一步研究。

既往研究已經證實，PLAG1在多種惡性腫瘤中如肝母細胞瘤和肌上皮癌中具有評估預后價值[18-20]。PLAG1在多種惡性腫瘤發生發展中也發揮重要作用。在肝細胞肝癌中，抑制PLAG1可顯著降低肝癌細胞的增殖和遷移侵襲能力，對于預測肝癌患者肝切除術后的預后具有重要意義[11]；在腎臟透明細胞癌中敲低PLAG1表達在體外能夠抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，并在體內能夠抑制腫瘤生長[21]；在卵巢癌中，PLAG1與卵巢癌化療敏感性有關[12]。已有研究發現，PLAG1能夠促進微衛星不穩定型CRC的發展和對5-氟尿嘧啶的耐藥性[22]，然而在CRC中PLAG1的預后意義尚不十分明確。在本研究中，高表達PLAG1者的OS和DFS短于低表達PLAG1者。此外，我們通過使用Cox比例風險回歸模型得出結論，PLAG1表達是CRC患者預后的獨立危險因素。

綜上所述，PLAG1在CRC中表達上調，其高表達與CRC患者的不良臨床特征和較差的預后相關。本研究為PLAG1在CRC中的臨床研究提供了理論基礎，提出了PLAG1可能作為調控CRC發生發展和預后的一個重要靶點，從而為CRC的診斷、臨床治療和預測預后提供新思路。