超聲波協同半仿生法提取靈芝三萜工藝優化

馬婧嘉 李雅茹 張文雋 郝 哲 屈文英 吳亞召 雷 萍*

（1陜西省微生物研究所，陜西西安 710043；2榆林市農墾服務中心，陜西榆林 719000；3洛川縣農業機械技術服務中心，陜西延安 727400）

靈芝Ganoderma lucidum，又名神芝、萬年蕈，現指隸屬于真菌界、擔子菌門、傘菌綱、多孔菌目、靈芝科的一類傳統藥用真菌的統稱[1]。現有研究表明靈芝三萜在抗腫瘤[2]、肝臟保護[3]、免疫促進[4]等方面都發揮著顯著作用，在食品和醫藥領域有廣泛的應用。

目前，靈芝三萜的提取方法有超臨界CO2提取、亞臨界水提取、超聲輔助提取、溶劑浸提、微波輔助提取法等[5]，這些傳統提取法存在提取效率低、時間長、耗能高等缺點。半仿生提取法（semi?bionicex‐traction，SBE）是以控制論“灰思維方式”為基礎的提取技術，可以提高藥物生物利用度，從生物藥劑學角度建立的一種新型提取技術[6?7]。超聲波輔助提取法廣泛應用于提取天然成分，其原理是利用超聲波產生的空化、振動、粉碎、攪拌等綜合效應，提高提取的效率[8]。目前，未見采用超聲波協同半仿生法從靈芝中提取三萜類化合物的研究報道。因此，筆者以靈芝為原料，采取超聲波協同半仿生法結合單因素與正交試驗，探究三萜類化合物提取工藝，以期為靈芝三萜的提取提供一種新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝：靈芝?LG，由陜西省微生物研究所提供；熊果酸，河南標準物質研發中心；鹽酸、無水乙醇、冰醋酸、氫氧化鈉、香草醛、高氯酸、乙酸乙酯，天津市天力化學試劑有限公司（均為分析純）。

1.2 儀器與設備

酸度計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TU?1901 雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；JP?120ST 超聲波清洗儀，深圳市結盟設備有限公司；TD5離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 靈芝粉的制備

新鮮靈芝子實體→洗凈曬干→60 ℃烘箱干燥（至恒重）→粉碎→過40目篩→靈芝粉。

1.3.2 超聲波協同半仿生法提取靈芝三萜

準確稱取按照1.3.1 制備靈芝粉樣品1 g，采用超聲波協同半仿生法，固定料液比、乙醇質量分數、超聲時間、提取溫度4 個因素，在模擬人體胃、腸道環境pH 值為1、4、7.5、8.3的溶液中依次分別提取靈芝三萜，在 4 000 r/min 條件下離心 10 min，合并 3 次上清液，定容至100 mL，作為待用供試品溶液。

1.3.3 靈芝三萜的測定

采用香草醛?高氯酸比色法測定靈芝三萜[9]。

1.3.4 靈芝三萜提取率的計算

靈芝三萜提取率計算：靈芝三萜提取率（質量比）=C×V/m%

式中：C（mg/mL）表示提取液中靈芝三萜的質量濃度；V（mL）表示提取液定容體積；m（mg）表示所用靈芝干粉質量。

1.3.5 單因素試驗設計

精確稱取1 g靈芝粉5份，按1.3.2的方法進行超聲波協同半仿生法提取靈芝三萜，分別設固定條件乙醇質量分數75%，料（g）液（mL）比為1∶25、提取溫度60 ℃，超聲時間20 min，分別設定5水平：料（g）液（mL）比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35；乙醇質量分數為75%、80%、85%、90%、95%；提取溫度40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃；超聲時間 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，考察不同因素對靈芝三萜的提取率影響。

1.3.6 正交試驗

以上述單因素試驗為基礎，選取表1 中4 因素3水平，采取L9（34）正交試驗對靈芝三萜的提取工藝參數進行優化。

李林，任校長19年來，他把“引導學生走向幸福”作為學校的辦學宗旨，積極探索教育規律，努力實施“以德立校，依法治校，科研興校，文化強校”的辦學策略，著力培養學生適應終身發展和社會發展需要的必備品格和關鍵能力。

表1 正交試驗因素水平

1.4 數據處理

用Office 軟件處理數據，運用GraphPad Prism 7.00作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對靈芝三萜提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比上升，靈芝三萜的提取率逐步提高，料液比為1∶30，靈芝三萜的提取率最高（2.71%）。可能加大溶劑的量后，增加了固相和液相之間三萜的含量差，加快三萜的溶出速率，從而提取率上升，當料液比達1∶30已充分溶出靈芝三萜，故料液比1∶30提取率最高。

圖1 不同料液比下靈芝三萜提取率

2.1.2 乙醇質量分數對靈芝三萜提取率的影響

由圖2 可知，乙醇質量分數為70%、80%、85%時，隨著乙醇質量分數上升，靈芝三萜提取率逐漸升高，乙醇質量分數為85%時三萜提取率最高（2.85%），再繼續提高乙醇質量分數，三萜的提取率反而降低。原因可能是過高的乙醇質量分數，導致其他醇溶性物質析出量增加，影響三萜類物質的溶出，因而三萜提取率不升反降。

圖2 不同乙醇質量分數下靈芝三萜提取率

2.1.3 提取溫度對靈芝三萜提取率的影響

由圖3 可知，靈芝三萜提取率隨著提取溫度的升高逐漸上升，在提取溫度60 ℃時靈芝三萜提取率最高（2.78%），再繼續升高溫度，提取率反而降低。可能過高提取溫度使三萜發生了分解，破壞了三萜結構[10]，導致提取率降低。

圖3 不同提取溫度下靈芝三萜提取率

提取靈芝三萜需要一定的時間溶出有效成分并達到傳質平衡。由圖4可知，超聲時間的延長，溶出的三萜增多，超聲時間30 min，三萜的提取率最高（2.82%），隨后三萜的提取率開始降低。這可能是因為溶出的無效成分和雜質增多，影響三萜類物質的溶出，因此超聲時間30 min 為靈芝三萜類物質提取的最佳時長。

圖4 不同超聲時間下靈芝三萜提取率

2.2 超聲波協同半仿生法提取靈芝三萜的工藝正交優化結果

正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析

由表2 和表3 可知，4 個試驗因素對靈芝三萜的提取率均有不同程度的影響，其影響的主次順序為：B（乙醇質量分數）>D（提取時間）>A（料液比）>C（超聲溫度）。乙醇質量分數對提取率的影響極為顯著，提取時間對提取率影響顯著，其余兩個因素不顯著。從R值得出的最佳工藝參數為A2B2C2D2，所對應的條件：料（g）液（mL）比為1∶30，乙醇質量分數為85%，提取溫度60 ℃，超聲時間30 min。與表2中的較優組合A2B2C3D1不一致。因此需要進一步驗證試驗（重復3次后取其平均值），結果見表4。

由表4 可知，超聲波協同半仿生法提取靈芝三萜的最佳工藝參數為A2B2C2D2，經過3 次驗證試驗，靈芝三萜的平均提取率為2.99%，高于正交試驗中的較優組合。

表4 正交試驗驗證結果

3 結論

試驗首次采取超聲波協同半仿生法提取靈芝三萜，考察了不同料液比、乙醇質量分數、超聲時間、提取溫度條件下靈芝三萜的提取率。單因素試驗及正交試驗結果表明，提取靈芝三萜的最佳工藝條件為料（g）液（mL）1∶30，乙醇質量分數85%，提取溫度60 ℃，超聲時間30 min。經過三次平行重復試驗，靈芝三萜的提取率為2.99%，試驗為靈芝三萜的提取提供了新的提取方法。