基于羊肚菌交配型檢測的半地下式暖棚減產原因分析

夏偉偉 高春燕 李 慧 賈保太 王朝江*

（1河北省農林科學院經濟作物研究所，河北石家莊 050051；河北省寧晉縣農業農村局，河北邢臺 055550）

羊肚菌栽培簡單粗放、效益高，是近幾年栽培面積急劇增加的食用菌之一。羊肚菌鮮菇上市越早價格越高，因此，北方掀起了暖棚栽培羊肚菌潮。半地下式暖棚相比平地式暖棚，具有更好保溫保濕的特點，成為栽培羊肚菌的理想場所。因此，有蔬菜大棚直接轉產或被租賃轉產羊肚菌。但有眾多大棚的栽培效果不理想，產量低，甚至絕收，且原因并非重茬引起的。

栽培羊肚菌需要購買大量栽培種、營養袋，每667 m2投入7 000~8 000 元，且初次栽培還需高薪聘請技術指導專家，所以一旦栽培失敗，就會損失慘重。許多栽培戶和研究人員將減產絕收的原因歸咎于菌種老化、污染，營養袋滅菌不徹底，原基形成期的環境不穩定等[1?2]。是否僅是上述原因造成減產絕收還有待商榷，如出菇環境調控因素，半地下暖棚的溫度逆境是可以調控的，在澆催菇水時基本不出菇，也不是大水逆境造成；雜菌因素，在筆者團隊指導的栽培戶，已具有識別菌種是否被污染的能力；滅菌因素，制備營養袋時，一般能控制好麥粒含水量，經高壓滅菌，雜菌已被徹底殺滅。因此，半地下式暖棚出現的低產、絕產的原因需要從其他方面深入細致地分析，以進一步為羊肚菌產業的持續發展提供技術支持。筆者針對當地合作社出現半地下式暖棚減產問題進行調研，并從菌絲存活狀態角度查找原因，現總結如下，供廣大栽培戶和同行參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用打孔器取4 個減產代表棚的菇體處、菇體外圍5 cm處、覆膜處有菌絲和無菌絲的2~5 cm深處土樣。取樣前刮去表層土2 cm，以排除菌霜DNA 干擾。每處取3個樣，3個取樣位點大體呈三角形。

羊肚菌交配型引物[3]由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。儀器為T100?PCR 儀，美國Bio?Rad 公司。

表1 羊肚菌交配型引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 減產的半地下式暖棚栽培管理情況調查

調查減產半地下式暖棚的栽培地點，所用棚結構、規格，土壤質地與播前處理以及栽培時間、品種、播種量、播種方式、發菌與催蕾等過程管理細節。

1.2.2 減產的半地下式暖棚出菇情況調查

調查包括出菇多寡、出菇位置、地表菌絲狀態和營養袋基質顏色變化等情況，而后歸納分析，并確定各型代表性棚為后續研究對象。

1.2.3 減產的代表棚羊肚菌菌絲存活狀態檢測

羊肚菌菌絲存活狀態指土層中菌絲有無、兩個交配型是否齊全，可通過羊肚菌交配型引物以土層中DNA 為模板的擴增產物電泳條帶測得，借以判斷土層中羊肚菌菌絲是否具備出菇能力。

土樣取回后壓爛，拌勻過篩（孔徑為0.85 mm），其中部分用于烘干法（55 ℃，24 h）測含水量（土樣中水/土樣濕重×100），部分用于CTAB法提取DNA。

提取DNA 以10 mL 離心管為容器，提取前預測得其最大濕土容量為3 g，2%CTAB 裂解液最大加量為2 000μL，1%CTAB 沉淀液最大加量為7 200μL，利用最大的樣品量獲取DNA，以排除因土樣量少造成的提取失敗干擾。

交配型擴增反應體系25μL，其中土樣DNA 2μL，上下游引物各1μL，2×ES Mix12.5μL，ddH2O 8.5 μL；擴增程序：94 ℃ 3 min，（94 ℃ 1 min，50 ℃30 s，72 ℃ 1 min）×32，72 ℃ 5 min[3]。

1.2.4 平地式暖棚的出菇情況調查

為準確找出半地下式暖棚減產原因，在寧晉縣堯臺村，選擇與其具有相同菌種來源、播種時間、播種量以及管理措施的同背景平地暖棚栽培區，進行對比調查。

2 結果與分析

2.1 減產的半地下式暖棚栽培管理調查結果

合作社栽培羊肚菌園區位于石家莊市鹿泉區李村，有80座半地下式暖棚，棚墻體三面土壘，棚底下沉0.6 m，棚長90 m，寬8 m，棚頂及棚陽面有膜搭茬通風孔隙，土壤為壤土。播種前15 d，每667 m2撒石灰100 kg，用小型旋耕機翻耕。播種前2 d栽培地澆透水，水下滲后播種。栽培品種為六妹系列G8，用種量為225 kg/667 m2，播種前將菌種揉碎至直徑0.5~1.0 cm顆粒。

2021 年 11 月 26 日播種，當時土壤溫度為 9 ℃，棚內溫度為7 ℃。播種方式采用平地按畦溝播，畦面寬1 m，畦間留0.3 m 走道。播種時將菌種均勻撒在開好的條狀溝內，然后整平，覆土3~5 cm。播種后畦面覆蓋扎有透氣孔的黑色塑料薄膜，膜寬同畦面。播種后3 d，土壤表面可見稀疏的菌絲，7 d菌絲量增多，10 d 后擺放外源營養袋，掀開塑料薄膜，放入營養袋后再蓋好薄膜。營養袋用量為2 200袋/667 m2，單袋濕重1 kg。

發菌期間溫度一直穩定在3~10 ℃，不噴水，覆膜避光培養菌絲。2 月25 日菌霜開始消退，菌絲變黃，畦面上已有少量原基形成，此時開始催蕾管理。方法是揭開塑料膜，晾3 d，然后大水漫灌整個畦面。同時溫度管理為中午棚外溫度高時，卷起覆蓋物提高棚溫；溫度低時，撐開通風口薄膜降溫，以拉大棚內溫差，如此刺激3~5 d，同時給以散射光照射。7~10 d 后，有些棚有原基出現，但在膜間走道原基多，畦面上少；有些棚20 d 后仍未現蕾。調查發現在澆催菇水前各棚土層表面均有大量菌霜，澆水后則全部消退，其間一直保持棚內溫度為6~14 ℃，土壤溫度8~12 ℃，空氣相對濕度85%~90%，均適合原基發生及子實體生長。

2.2 減產的半地下式暖棚出菇情況

現場調查多個菇棚后，發現所謂出菇多的棚內也出菇不多；地表菌霜消退，說明催菇水有清退菌霜的作用；營養袋基質變黑塌癟，說明基質持續處于高水分環境中，在細菌作用下腐敗變質。根據出菇量和地表有無菌絲可將減產菇棚分為4 種類型（圖1）。

多菇棚（圖1a）。此棚特點是出菇多的位置在薄膜搭茬的間隙走道區，順走道遠觀似一條菇帶，而覆膜處散生菇稀疏。覆膜下和膜間隙地面都有菌絲冒出土層，后者也比前者多，且成片或有菌霜，發白呈帶狀。但因澆催菇水前的菌霜已消失，此應為二次菌霜。

少菇棚（圖1c）。該棚出菇情況同多菇棚，差別是膜間隙區域的菇更少。

無菇有菌絲棚（圖1b）。此棚薄膜覆蓋面和膜間隙處都無菇，但覆膜處有散片狀分布的菌絲，膜間隙處能看到條帶狀發白的菌絲或菌霜。

無菇無菌絲棚（圖1d）。該棚情形和無菇有菌絲棚相近，不同之處是在覆膜處連散片狀的菌絲也沒有，膜間隙處有菌絲或顯菌霜。

圖1 4種減產的半地下式暖棚

另外，無菇有菌絲棚在催菇前是有原基或幼菇的，澆水后不再出菇，表明催菇時，澆水對菇體有損害。多菇棚、少菇棚出菇部位本應在覆膜處畦面，但出菇量比膜間隙區還稀疏，表明覆蓋薄膜明顯抑制出菇。覆膜的畦面與膜間隙處的差別，主要是后者透氣性好，故推測覆膜傷害絲，使菌絲活力下降，不但影響出菇，且對催菇水造成的逆境抵抗力變弱（表2）。

2.3 減產的半地下式暖棚羊肚菌菌絲存活狀態

烘干法測得菌絲含水量為16.5%~16.8%，雖偏低，但取樣時卻極易捏成團塊。

羊肚菌兩個交配型引物擴增的7 個位點，共21個重復的土樣（土樣來源編號如表2）中菌絲DNA產物電泳條帶見圖2，圖2 中上半部為Ⅰ型產物，下半部為Ⅱ型產物，同一土樣的Ⅰ、Ⅱ交配型產物電泳圖上下對應。

圖2 土樣DNA兩個交配型擴增產物電泳圖

表2 減產的半地下式暖棚出菇表現

由圖2可以看出，2個交配型在同一土樣中被檢出，或1個交配型被檢出的機會隨著出菇變少、菌絲消失而明顯降低；任一交配型未檢出的機會，在各種出菇狀態下都存在，催菇水前后無菇也無菌絲的檢出機會最高，與各棚出菇多少和不出菇的表現基本吻合。說明出菇的土層中羊肚菌菌絲并不密，且出菇邊土層菌絲又比出菇處土層少；菌絲分布在淺層土；栽培期間羊肚菌菌絲存在減少消亡現象。

2.4 平地式暖棚出菇情況

該類棚出菇整體良好，菇密集區位于覆膜下，未出現成片無菇區，覆膜間隙的菇大部分在覆膜的邊緣，呈明顯的菇壟狀，間隙區菇少呈空心狀態（圖3）。結合減產半地下式暖棚多菇處2 個交配型菌絲檢出機會多的結果，表明正常高產菇棚，覆膜下才是出菇多和菌絲密集的地方；營養袋基質多呈白色，表明覆膜期間細菌腐敗程度低。

圖3 平地式暖棚羊肚菌出菇

兩種暖棚的出菇現狀表明，同等情況下，僅棚底是否下沉結構差別就可帶來不同的栽培羊肚菌效果。

3 小結與討論

3.1 羊肚菌菌絲存活狀態制約其產量

出菇不穩定是羊肚菌生產的最大問題和難點，兩個交配型基因同時存在，才能實現子實體正常發育和產生子囊孢子[3]，并引導研究者將解決不出菇問題的側重點放在菌種的交配型檢測上[4]。研究則進一步證明，即使在相同菌種的遺傳背景下，土層中羊肚菌菌絲仍存在著數量減少、交配型丟失等存活狀態變化，從而導致減產、絕產等后果。

3.2 覆膜等常規管理影響羊肚菌菌絲存活狀態

首先從菌絲由多變少和轉向間隙區出菇的成因分析，相對于膜間隙區覆膜下部是羊肚菌菌種和營養袋密集處。半地下式暖棚的覆膜下出菇卻少于間隙區，而兩區在覆膜前的菌絲表觀狀態基本相同，據此推測覆膜改變了菌絲存活狀態。對于土壤水分高且易保持的半地下暖棚來說，長時間覆膜（即使膜上有透氣孔）因水的反復蒸發和凝結滴落終究會造成表層土濕度高、缺氧。羊肚菌是好氧菌，且菌絲主要分布在淺層土，長時間缺氧必然導致其生長乏力或死亡。

分析澆催菇水前有菇而后不出菇的成因可知，覆膜下菌絲數量、存活狀態與覆膜造成的缺氧狀態相關，存在高濕度下菌絲變少、活力變弱的情形，此時再遇大水（催菇水），缺氧加重，菌絲進一步弱化，最后導致水后無菇。

由此可見，覆膜雖可促進羊肚菌菌絲萌發，保持土壤墑情，提高菌絲活力，但因半地下式暖棚棚底含水量高，濕度過高阻斷氧氣供給，從而抑制菌絲活力，最后導致減產或絕收。因此，覆膜有利弊，切忌機械照搬。把握好覆膜時間，在覆膜后根據墑情適當透氣。