HPLC-CAD分析黃芪甲苷提取過程中黃芪皂苷類成分動態變化

劉蓬蓬，鞠成國，林桂梅，聶紫璇，任天航

遼寧中醫藥大學藥學院，國家中醫藥管理局中藥炮制工藝原理重點研究室，遼寧省中藥炮制專業技術創新中心，遼寧 大連 116600

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功。現代研究表明，黃芪主要含有皂苷類、黃酮類和多糖類成分，具有抗菌、抗炎、增強免疫調節、抗氧化、抗疲勞、抗骨質疏松等藥理作用[1-4]。

《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）自1995年版起以黃芪甲苷作為評價黃芪藥材和飲片質量的指標性成分之一，且1995－2000年版《中國藥典》測定黃芪甲苷的方法均采用薄層掃描法[5-6]，2005年版《中國藥典》首次采用HPLC 測定黃芪甲苷含量[7]。1995－2015年版《中國藥典》黃芪甲苷的基本提取步驟未發生改變，僅對個別步驟的溶液使用量進行了更改[5-9]。2015年版《中國藥典》黃芪甲苷提取操作過程為：“取本品中粉約4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，放冷，通過D101 型大孔吸附樹脂柱（內徑1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。”[9]該提取工作較為繁瑣、耗時，2020年版《中國藥典》黃芪甲苷的提取過程雖有簡化，但依然保留了加入氨試液進行提取的操作[10]。

本研究根據《中國藥典》方法，對黃芪甲苷提取過程的主要步驟進行拆分，分析提取過程中黃芪皂苷類成分的變化情況，為制訂新的黃芪甲苷提取方法提供依據，并為黃芪藥材和飲片的質量評價提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AB 高效液相色譜儀，日本島津公司；Corona 電霧式檢測器，美國ESA 公司；METTLER AE240型十萬分之一分析天平，瑞士METTLER公司；FA1004B型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；YP5102 型電子天平，上海光正醫療儀器有限公司；Milli-Q純水儀，美國Millipore公司。

黃芪購自遼寧省朝陽市朝陽縣黃芪GAP（中藥材生產質量管理規范）種植基地，經遼寧中醫藥大學王冰教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根。黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪甲苷（黃芪皂苷Ⅳ）對照品，成都曼斯特生物科技有限公司，批號分別為MUST-16012906、MUST-16031010、MUST-16022804，純度≥98%；正丁醇、氨水、乙醇、甲醇為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號分別為20190111、20190513、20191109、20190312；甲醇、乙腈為色譜純，美國Sigma公司，批號分別為193172、191839；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

取原藥材，除去雜質，洗凈，潤透，切厚片，干燥，粉碎（過4號篩），備用。

2.2 對照品溶液制備

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 索氏提取（A法）

取樣品粉末4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 索氏提取和正丁醇萃取（B法）

取樣品粉末4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 索氏提取和正丁醇萃取并經D101型大孔吸附樹脂柱洗脫（C法）

取樣品粉末4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，殘渣加水5 mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內徑1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 索氏提取和正丁醇萃取并經氨試液洗滌（D法）

取樣品粉末4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.5 按藥典全過程提取（E法）

老區革命紀念館的發展一定要在發揮紅色資源的同時依據當地具體情況，定位清晰，統一思想。革命紀念館只有負重拼搏,與時俱進,紅色旅游才將成為革命紀念館更快發展的強勁推動力。

取樣品粉末4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內徑1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 色譜條件

采用Ecosil C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相A為純水、B為乙腈，梯度洗脫（0.01～20 min，32%～32%B；20～25 min，32%～40%B；25～35 min，40～45%B；35～45 min，45%B；45～46 min，45%～100%B；46～70 min，100%B；70～71 min，100%～32%B；71～78min，32～32%B）[11-13]，流速1.0mL/min，進樣量10 μL，氮氣壓力35 psi，高頻濾波，量程200 pA。色譜圖見圖1。

圖1 黃芪甲苷拆分提取過程中皂苷成分HPLC圖

2.5 線性關系考察

精密吸取黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪甲苷對照品溶液適量，按“2.4”項下色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果3種成分線性關系良好，見表1。

表1 3種成分線性關系考察結果

2.6 精密度試驗

精密吸取各對照品溶液10 μL，按“2.4”項下色譜條件，重復進樣6次，測得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷峰面積的RSD分別為0.9%、1.2%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24 h進樣，按“2.4”項下色譜條件，測得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷峰面積的RSD 分別為1.3%、1.7%、1.6%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品6份，按“2.3.1”項下A法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件，測得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷峰面積的RSD 分別為1.5%、1.9%、1.8%，表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取同一批已知含量的A法提取樣品4 g，平行6份，精密稱定，分別精密加入黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷對照品溶液適量，按“2.3.1”項下A法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結果黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷的平均回收率分別為100.5%、99.6%、101.3%，RSD分別為1.6%、2.0%、1.9%，表明該方法準確率高。

2.10 含量測定

取黃芪樣品，按“2.3”項下各法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷的含量，結果見表2。

表2 黃芪甲苷拆分提取過程中黃芪皂苷類成分含量（mg/g，n=3）

可以看出，黃芪甲苷提取過程中，黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅱ在氨試液洗滌前含量較高、黃芪甲苷含量較低，而經氨試液洗滌后，黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅱ的含量顯著降低、黃芪甲苷含量顯著升高。B法與A法比較，黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷在經水飽和正丁醇萃取后含量亦降低，表明水飽和正丁醇的萃取效率不高，引起的損耗較大。而C法與B法、E法與D法比較可見，黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷的含量無明顯差異，表明經D101型大孔吸附樹脂柱洗脫富集這一步驟可以省略。

2.11 單體轉化試驗

吸取氨試液適量，分別加入黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷對照品溶液中，按“2.4”項下色譜條件測定分析，色譜圖見圖2，黃芪皂苷類成分轉化途徑見圖3。

圖2 黃芪皂苷單體轉化HPLC圖

圖3 黃芪皂苷類成分轉化途徑

可見，黃芪皂苷Ⅱ在經氨試液洗滌后會脫掉木糖基2位上的乙酰基轉化生成黃芪甲苷，而黃芪皂苷Ⅰ在經氨試液洗滌后先脫掉木糖基3位上的乙酰基生成黃芪皂苷Ⅱ，再進一步轉化生成黃芪甲苷。

3 討論

本研究結果表明，黃芪甲苷提取過程中在經氨試液洗滌后黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ發生了量變與質變，而黃芪甲苷發生了量變，故采用經氨試液作用轉化而來的黃芪甲苷數據結果進行黃芪質量評定欠妥，無法客觀、真實反映黃芪中黃芪甲苷含量。本研究發現，黃芪中黃芪皂苷Ⅰ含量較高且穩定，故建議將《中國藥典》黃芪項下的皂苷類成分評價指標由黃芪甲苷修訂為黃芪皂苷Ⅰ較為合理。此外，本研究對拆分黃芪甲苷提取過程中的黃芪皂苷Ⅲ含量變化情況亦進行了測定分析，而黃芪皂苷Ⅲ含量未發生明顯變化，表明氨試液不會引起黃芪皂苷Ⅲ變化。同樣，水飽和正丁醇對黃芪皂苷Ⅲ的萃取效率亦不高，引起損耗較大。

黃芪中的皂苷類成分無紫外吸收，一般采用蒸發光散射檢測器（ELSD）進行檢測分析。ELSD是散射光的對數響應值與組分的質量的對數呈線性關系，但此對數關系變異性較大，且其靈敏度較低，最低檢測限在50～100 ng。本研究采用的電噴霧檢測器較ELSD具有更高的靈敏度，對無紫外吸收化合物的最低檢測限達到1 ng，更適用于含有較弱或無紫外吸收的皂苷類成分分析[14]。

《中國藥典》黃芪含量測定項下尚有另一指標性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷，但中藥成分復雜，是以多成分多靶點綜合發揮藥效作用。黃芪中包括皂苷類成分如黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪甲苷等，以及毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、2"-羥基-3",4"-二甲氧基-異黃烷-7-O-β-D-葡萄糖苷、7,2"-二羥基-3",4"-二甲氧基-異黃烷、9,10-二甲氧基-紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、3-羥基-9,10-二甲氧基-紫檀烷等黃酮類成分，故建議可選取上述多種成分同時作為指標性成分，通過采用HPLC技術建立黃芪飲片多成分指紋圖譜和多成分含量的限定范圍，對黃芪飲片質量進行整體、客觀的評價，從而為臨床應用、中藥制劑生產提供藥效穩定、質量可控的黃芪飲片。