參苓白術散對腸道菌群失調幼鼠肺部免疫炎癥反應的影響

武妍琳，劉喜平，，賈育新，王小榮，武燕，李永玉，張映紅，劉苗

1.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000

免疫炎癥反應是肺部感染、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、膿毒癥肺損傷等多種呼吸系統疾病發病的重要病理環節?？股貫E用加重了病原菌感染后肺部炎癥的進展，尤其嬰幼兒呼吸道黏膜免疫發育不成熟，增加了患兒病死率[1]。研究發現，腸道菌群通過“腸-肺軸”對遠端呼吸道黏膜免疫炎癥反應有重要影響[2]。嬰幼兒消化系統發育不完善，腸道菌群平衡尚未完全建立，抗生素濫用誘發腸道菌群失調，進而引起呼吸道黏膜免疫功能低下，加重嬰幼兒肺部炎癥反應，進而導致肺部感染及多種呼吸系統疾病的發生發展[3-4]。

參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》，由人參、茯苓、白術、山藥、白扁豆、蓮子肉、薏苡仁、砂仁、桔梗、炙甘草組成，能健脾祛濕、培土生金，臨床廣泛應用于肺部感染、社區獲得性肺炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等呼吸系統疾病的輔助治療，可有效緩解癥狀，提高臨床療效[5]。研究表明，參苓白術散能調節腸道菌群，增強機體免疫功能[6]，抑制反復呼吸道感染及肺炎患者機體炎癥反應[7-9]。但其具體作用機制仍不清楚。因此，本研究通過抗生素誘導腸道菌群失調幼鼠模型，觀察參苓白術散對模型幼鼠肺部免疫炎癥反應的影響，以期為臨床應用提供依據。

1 實驗材料

1.1 動物

3～4周齡SPF級健康雄性Balb/c幼鼠60只，體質量（16±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級動物實驗中心，溫度（21±1）℃、相對濕度60%～70%環境，12 h光暗周期，予標準飼料和清潔自來水喂養。本實驗經甘肅中醫藥大學動物倫理委員會審批（2020-264）。

1.2 藥物

參苓白術散組方藥物飲片購自甘肅中醫藥大學附屬醫院中藥房，并由甘肅中醫藥大學藥學院景明教授鑒定為正品。依據原方比例，參照現代臨床劑量（麩炒白術15 g，山藥15 g，茯苓15 g，生曬參15 g，白扁豆12 g，蓮子肉9 g，麩炒薏苡仁9 g，砂仁6 g，桔梗6 g，炙甘草10 g）[10]，將飲片混合后浸泡30 min，煎煮2次，第1次加8倍量水，煎煮1.5 h，第2次加6倍量水，煎煮1 h，合并2次煎煮液，過濾、濃縮至原藥材濃度為1.12 g/mL。雙歧桿菌四聯活菌片，杭州遠大生物制藥有限公司，批號202005244，取適量藥片粉碎后與生理鹽水混合，配制成濃度為68 mg/mL溶液。氨芐西林，珠海聯邦制藥股份有限公司，批號96003103。鹽酸萬古霉素，上海源葉生物科技有限公司，批號H13M11Y113102。硫酸新霉素、兩性霉素B、甲硝唑，北京索萊寶科技有限公司，批號分別為70210512、511B059、827L021。

1.3 主要試劑與儀器

脂多糖（LPS）、HE染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，批號分別為408Z033、20190430；小鼠免疫球蛋白（Ig）G、IgM、IgA多因子ELISA檢測試劑盒，小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-10、干擾素-γ（IFN-γ）多因子ELISA檢測試劑盒，杭州聯科生物技術股份有限公司，批號分別為A00924、202012。Specra Max i3x 型多功能酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Z216MK型冷凍離心機，德國Hermle公司；TS-8型搖床，上海精密儀器制造公司；EG1150型石蠟包埋機、RM2016型石蠟切片機，德國Leica公司；IX51-A12PH型熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司；Illumina NovaSeq測序平臺，美國Illumina公司。

2 實驗方法

2.1 混合抗生素溶液配制

參考文獻[11]方法制備混合抗生素溶液：將氨芐西林、甲硝唑、硫酸新霉素、鹽酸萬古霉素、兩性霉素B與生理鹽水混合，配制成濃度分別為10、10、10、5、0.1 mg/mL溶液。

2.2 造模及分組

從60只幼鼠中隨機抽取10只作為空白組，剩余50只幼鼠參考文獻[11]方法造模：每12 h灌胃混合抗生素溶液誘導幼鼠腸道菌群紊亂，灌胃體積10 mL/kg，連續21 d。末次灌胃后12 h，采用隨機數字表法將50只造模幼鼠分為模型組、陽性對照組及參苓白術散高、中、低劑量組，每組10只。根據體表面積換算各組等效劑量[12]，陽性對照組予0.68 g/kg雙歧桿菌四聯活菌片溶液灌胃，參苓白術散高、中、低劑量組分別予29.12、14.56、7.28 g/kg參苓白術散水煎液灌胃，每日1次，連續7 d?？瞻捉M和模型組予等量生理鹽水灌胃。

2.3 16S rDNA測序分析

干預結束后，無菌收集幼鼠糞便，液氮中快速冷凍，置于-80 ℃冰箱保存。每組隨機選取6個樣本，委托蘇州帕諾米克生物科技有限公司進行糞便DNA提取、引物合成、DNA測序和腸道菌群多樣性檢測。通過Illumina NovaSeq測序平臺提取全基因組DNA，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域，使用帶Barcode的特異引物和高效高保真酶進行PCR。通過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用NovaSeq 6000進行上機測序。利用Uparse聚類所有樣本的Effective Tags，默認將序列聚集到一致性為97%的OTUs中，將出現頻率最高的序列作為OTUs的代表序列，作物種分類注釋（設置閾值為0.8～1）。根據OTUs分類分析腸道微生物的物種多樣性和物種差異。

2.4 一般狀態觀察

收集糞便后，除空白組外，其余各組幼鼠以4%水合氯醛腹腔注射（0.01 mL/g）麻醉，參考文獻[13]方法，將幼鼠仰臥位固定于45°平板上，用微量進樣針吸取1 g/L LPS 50 μL滴于幼鼠咽后壁，誘導炎癥反應。每日觀察記錄幼鼠飲食量、毛發狀態、活躍度、體質量等。

2.5 肺組織病理形態觀察

LPS一次性誘導后第8日，水合氯醛腹腔注射麻醉幼鼠，仰臥位固定，取肺組織，沖洗后固定于10%多聚甲醛24 h，石蠟包埋，切片（6～10 μm），常規HE染色，鏡下觀察肺組織病理變化，并進行病理學評分[14]。

2.6 ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液白細胞介素-10、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α含量

分離幼鼠頸部皮膚，暴露氣管，留置針插管，預冷無菌PBS沖洗全肺2次，每次0.5 mL，回收沖洗液，室溫靜置4 h，4 ℃、1 200 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，取上清液，按ELISA 試劑盒說明書檢測IL-10、IFN-γ、TNF-α含量。

2.7 ELISA 檢測血清免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、免疫球蛋白A含量

幼鼠麻醉后腹主動脈采血，室溫靜置1 h，4 ℃、1 200 r/min（離心半徑10 cm）離心5 min，分離血清，按ELISA試劑盒說明書檢測IgG、IgM、IgA含量。

3 統計學方法

4 結果

4.1 參苓白術散對模型幼鼠腸道菌群多樣性的影響

基于幼鼠腸道菌群α多樣性指數繪制稀釋曲線，由圖1可知，樣本數量合理、充足。Shannon指數表示物種多樣性，Shannon指數越大則菌群多樣性越高、物種分布越均勻。與空白組比較，模型組幼鼠腸道菌群Shannon指數明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組和參苓白術散各劑量組幼鼠腸道菌群Shannon指數均明顯升高（P<0.01）；與參苓白術散低劑量組比較，參苓白術散高、中劑量組幼鼠腸道菌群Shannon指數明顯降低（P<0.01）。見表1。主坐標分析（PCoA）結果顯示，第一主成分可以解釋組間61.29%的差異，第二主成分可以解釋組間10.41%的差異，見圖2。同時進行組間相似性分析（ANOSIM）顯示，空白組和模型組之間r=1，P=0.007，提示組間差異顯著。

圖1 各組幼鼠腸道菌群稀釋曲線

表1 各組幼鼠腸道菌群Shannon指數比較（）

表1 各組幼鼠腸道菌群Shannon指數比較（）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與參苓白術散低劑量組比較，△△P<0.01

Shannon指數4.54±0.35 1.29±0.50**2.81±0.30##2.73±0.35##△△2.51±0.22##△△3.53±0.16##組別空白組模型組陽性對照組參苓白術散高劑量組參苓白術散中劑量組參苓白術散低劑量組只數6 6 6 6 6 6

圖2 各組幼鼠腸道菌群PCoA

4.2 參苓白術散對模型幼鼠腸道菌群結構的影響

在門分類水平上，與空白組比較，模型組幼鼠腸道變形菌門Proteobacteria豐度明顯增加（P<0.01），擬桿菌門Bacteroidota、厚壁菌門Firmicutes豐度明顯減少（P<0.01），疣微菌門Verrucomicrobiota差異無統計學意義（P>0.05）；與模型組比較，陽性對照組和參苓白術散各劑量組幼鼠腸道變形菌門豐度均明顯減少（P<0.01），擬桿菌門、厚壁菌門豐度均明顯增加（P<0.01），陽性對照組和參苓白術散高、低劑量組幼鼠腸道疣微菌門豐度明顯增加（P<0.05，P<0.01）。見圖3。

圖3 各組幼鼠腸道菌群門水平物種疊加

在科分類水平上，與空白組比較，模型組幼鼠腸道腸桿菌科Enterobacteriaceae 豐度明顯增加（P<0.01）， 木 蘭 科 Muribaculaceae、 擬 桿 菌 科Bacteroidaceae豐度明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組和參苓白術散各劑量組幼鼠腸道腸桿菌科豐度均明顯減少（P<0.01），參苓白術散低劑量組幼鼠腸道木蘭科豐度明顯增加（P<0.01），陽性對照組和參苓白術散高、中劑量組幼鼠腸道擬桿菌科豐度明顯增加（P<0.01）。見圖4。

圖4 各組幼鼠腸道菌群科水平物種疊加

4.3 參苓白術散對模型幼鼠一般狀態的影響

空白組幼鼠精神狀態良好，反應靈敏，毛發順滑光亮，進食正常，糞便正常；模型組幼鼠從LPS誘導肺部炎癥后第1日開始出現精神萎靡、豎毛，飲水和進食量減少，體質量減輕；陽性對照組和參苓白術散各劑量組幼鼠自第3日開始精神狀態好轉，毛發逐漸柔順，大便成形，食量及體質量逐漸增加，至第6日基本恢復正常，其中以參苓白術散高劑量組最為顯著。見表2。

表2 各組幼鼠誘導肺部炎癥后不同時點體質量變化（，g）

表2 各組幼鼠誘導肺部炎癥后不同時點體質量變化（，g）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與參苓白術散高劑量組比較，△P<0.05，△△P<0.01

組別空白組模型組陽性對照組參苓白術散高劑量組參苓白術散中劑量組參苓白術散低劑量組第7日19.28±0.26 16.33±0.10**19.23±0.30##19.12±0.17##18.87±0.23##18.38±0.13##△△只數6 6 6 6 6 6第1日18.30±0.46 17.47±0.12**17.87±0.12 17.83±0.16 17.87±0.15 17.73±0.22第2日18.50±0.43 16.97±0.14**18.02±0.17##17.85±0.18##17.88±0.17##17.70±0.22##第3日18.58±0.38 16.82±0.15**18.25±0.19##18.13±0.16##18.08±0.21##17.82±0.20##第4日18.87±0.33 16.57±0.20**18.55±0.22##18.48±0.08##18.33±0.27##18.03±0.18##△第5日19.07±0.29 16.47±0.12**18.82±0.22##18.70±0.15##18.52±0.20##18.22±0.23##△△第6日19.25±0.29 16.38±0.10**19.02±0.26##18.95±0.14##18.73±0.24##18.32±0.19##△△

4.4 參苓白術散對模型幼鼠肺組織病理變化的影響

HE染色顯示，空白組幼鼠肺組織染色均勻，肺泡結構清晰正常。與空白組比較，模型組幼鼠肺組織細支氣管/支氣管周圍炎性細胞浸潤范圍和程度明顯增加，肺組織損傷嚴重，可見大面積出血；與模型組比較，陽性對照組和參苓白術散各劑量組幼鼠肺組織炎癥病理變化均有所減輕，其中以參苓白術散高、中劑量組最為顯著。見圖5。與空白組比較，模型組幼鼠肺組織病理評分明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組和參苓白術散各劑量組幼鼠肺組織病理評分均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見表3。

圖5 各組幼鼠肺組織形態（HE染色，×200）

表3 各組幼鼠肺組織病理評分比較（，分）

表3 各組幼鼠肺組織病理評分比較（，分）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

病理評分2.00±1.00 20.00±1.73**6.67±1.53##7.33±1.15##14.67±1.15##16.33±1.53#組別空白組模型組陽性對照組參苓白術散高劑量組參苓白術散中劑量組參苓白術散低劑量組只數6 6 6 6 6 6

4.5 參苓白術散對模型幼鼠支氣管肺泡灌洗液白細胞介素-10、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α含量的影響

與空白組比較，模型組幼鼠支氣管肺泡灌洗液IL-10含量明顯減少，IFN-γ、TNF-α含量明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組和參苓白術散高劑量組幼鼠支氣管肺泡灌洗液IL-10含量明顯增加，陽性對照組和參苓白術散高、中劑量組幼鼠支氣管肺泡灌洗液IFN-γ、TNF-α含量明顯減少，差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。見表4。

表4 各組幼鼠支氣管肺泡灌洗液IL-10、IFN-γ、TNF-α含量比較（，pg/mL）

表4 各組幼鼠支氣管肺泡灌洗液IL-10、IFN-γ、TNF-α含量比較（，pg/mL）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別空白組模型組陽性對照組參苓白術散高劑量組參苓白術散中劑量組參苓白術散低劑量組TNF-α 315.00± 30.7 552.00± 22.8**360.00± 34.2##372.00± 85.3##417.00± 22.8##519.00±171.9只數5 5 5 5 5 5 IL-10 1 225.8± 30.1 868.2± 52.0**1 197.0± 66.3##1 143.4± 78.9#820.2±293.9 921.0± 48.0 IFN-γ 613.5±118.9 949.5± 81.1**679.5± 69.1##721.5± 83.3##763.5±100.4##865.5± 91.5

4.6 參苓白術散對模型幼鼠血清免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、免疫球蛋白A含量的影響

與空白組比較，模型組幼鼠血清IgM含量明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組和參苓白術散各劑量組幼鼠血清IgM含量明顯減少（P<0.05，P<0.01），以高劑量組差異最顯著（P<0.01）。各組IgG、IgA差異無統計學意義（P>0.05）。見表5。

表5 各組幼鼠血清IgG、IgM、IgA含量比較（，ng/mL）

表5 各組幼鼠血清IgG、IgM、IgA含量比較（，ng/mL）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與參苓白術散高劑量組比較，△△P<0.01

組別空白組模型組陽性對照組參苓白術散高劑量組參苓白術散中劑量組參苓白術散低劑量組IgA 57.14±10.77 62.29±10.42 58.86± 7.72 58.67±10.02 58.29± 7.93 59.43± 7.45只數5 5 5 5 5 5 IgG 855.00±102.62 951.00± 86.43 879.00± 82.16 897.00± 69.07 903.00±106.91 939.00± 88.46 IgM 31.63±0.59 36.12±0.60**32.02±0.49##31.59±0.90##34.27±0.46##△△35.04±0.49#△△

4.7 相關性分析

將腸道菌群門、科水平的主要菌種與IL-10、IFN-γ、TNF-α、IgM進行Pearson相關性分析。不同菌群的豐度變化與支氣管肺泡灌洗液炎癥因子及血清特異性抗體含量存在不同程度的相關性，變形菌門、腸桿菌科豐度與支氣管肺泡灌洗液IFN-γ含量呈顯著正相關（P<0.05），擬桿菌門豐度與支氣管肺泡灌洗液IFN-γ含量呈顯著負相關（P<0.05）；厚壁菌門豐度與支氣管肺泡灌洗液IFN-γ、TNF-α及血清IgM含量呈極顯著負相關（P<0.01），與IL-10含量呈顯著正相關（P<0.05）。見表6。

表6 腸道菌群與炎癥因子及特異性抗體的相關性分析

5 討論

正常的腸道菌群為人體生態平衡提供調節作用，包括對調節免疫功能和機體代謝、增加胃腸動力、對病菌的抵抗等。嬰幼兒時期呼吸道感染與菌群多樣性減少密切相關。研究發現，腸道菌群通過“腸-肺軸”影響呼吸系統疾病的病理和免疫功能[15]，腸道菌群失調引起的免疫反應可影響肺部炎癥反應，同時也可通過腸黏膜系統和免疫活性因子對機體免疫產生影響[16-18]。中藥對腸道菌群的調節相比西藥具有全面、雙向調節的優勢，既能促進益生菌生長，又可抑制有害菌繁殖[19-21]。

本研究通過16S rDNA高通量測序技術分析不同劑量參苓白術散對腸道菌群結構的影響，結果模型組幼鼠腸道厚壁菌門、擬桿菌門豐度顯著減少，變形菌門豐度顯著增加，菌群豐度及多樣性發生變化。厚壁菌門、擬桿菌門是健康宿主共有的優勢菌群[3]。不同劑量參苓白術散對腸道菌群的豐度及多樣性均有明顯回調作用，其中以低劑量組最為顯著。在科水平上，模型組幼鼠腸道腸桿菌科豐度顯著增加，木蘭科、擬桿菌科豐度顯著減少，不同劑量參苓白術散干預后，菌群豐度明顯回調。腸桿菌科中豐度較低的腸桿菌屬和克雷伯菌屬等在菌群失調期間可能過度生長和占主導地位[22-23]。克雷伯菌屬中的克雷伯桿菌常寄生于動物呼吸道或腸道，為條件病原菌，是引起人類肺炎的病原菌之一，特別是免疫功能低下的新生兒和老年人[24-25]。另外，Deng等[26]研究顯示，腸道菌群木蘭科的波動可能對炎癥和腫瘤發生率有顯著影響。

LPS是引起急性肺損傷、膿毒癥等病癥的重要致病因子，能促進炎癥因子產生，引起肺內中性粒細胞聚集和激活。IL-10可通過抑制核因子-κB激活，從而抑制急性肺損傷大鼠肺泡巨噬細胞釋放TNF-α、IL-1β等前炎性細胞因子，減輕肺部炎癥反應[27]。韓俊閣等[28]發現，高氧刺激下，小鼠肺和大腸黏膜免疫因子TNF-α、IL-1β等具有同步性，這可能是“肺與大腸相表里”的重要生物學基礎。本實驗中，參苓白術散各劑量組幼鼠支氣管肺泡灌洗液中促炎因子TNF-α、IFN-γ含量減少，抑炎因子IL-10含量增加，表明參苓白術散對LPS誘導的肺部炎癥有明顯改善作用。此外，不同劑量參苓白術散干預后血清IgM含量顯著減少，但IgG和IgA含量無明顯變化。IgM可作為早期感染的診斷指標，其變化一定程度上說明菌群失調導致肺部免疫感染加重。

相關性分析顯示，參苓白術散對有益菌的調節與對免疫反應的調節呈正相關性，說明參苓白術散不僅具有益氣健脾、滲濕止瀉之功，又可調節腸道菌群和人體免疫功能，提示其可能通過改善腸道菌群結構和多樣性提高肺部免疫功能，為闡明“肺與大腸相表里”的機制奠定了基礎，可為進一步探討“培土生金”法防治腸道菌群失調相關肺部免疫疾病提供依據。

綜上，參苓白術散可調節抗生素誘導的菌群失調幼鼠菌群豐度及多樣性，調整腸道菌群結構，改善肺部免疫炎癥反應，但腸道菌群結構與組成相對復雜，目前仍有部分腸道菌群及其生物學意義尚無法完全闡明，還需進一步深入探討。