基于網絡藥理學、分子對接和實驗驗證探討固本解毒方治療肺癌作用機制

朱冬菊，樸炳奎，楊晨，白建琦，秦騰騰，朱宏偉，張平

1.中國中醫科學院望京醫院，北京 100102；2.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053

統計數據顯示，肺癌發病率和病死率居全球惡性腫瘤首位，2020年新發220萬例，死亡約180萬例[1-2]，43%的非小細胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）患者確診時已是晚期[3]。原發灶NSCLC細胞易擴散至淋巴結、對側肺和遠處器官（如骨、腦和肝），這些器官對最初的抗腫瘤治療反應低，治療后復發頻率高，患者生存率低，預后惡劣[4]。

中醫藥在治療肺癌方面具有獨特優勢。固本解毒方為中國中醫科學院廣安門醫院樸炳奎教授治療肺癌的經驗方，長期臨床實踐表明其療效確切，但其作用機制尚未闡明[5-6]。因此，本研究采用網絡藥理學方法，結合分子對接和實驗驗證，探討固本解毒方治療肺癌的有效活性成分和作用靶點，為相關研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 固本解毒方活性成分篩選

通過TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和本草組鑒（HERB，http://herb.ac.cn/）搜索固本解毒方藥物北沙參、續斷、骨碎補、牛膝、黃芪、補骨脂、當歸、太子參、半枝蓮、土茯苓、白花蛇舌草、桔梗、甘草成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18[7]為條件篩選，獲得固本解毒方活性成分。

1.2 固本解毒方藥物靶點篩選

利用PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[8]下載藥物活性成分的2D結構，上傳至SwissTargetPrediction數 據 庫 （http://www.swisstargetprediction.ch/）[9]預測潛在靶點，去除重復靶點，輸入UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）[10]，對靶點進行標準化。

1.3 疾病靶點篩選

以“Lung cancer”為關鍵詞，檢索GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），選取GSE136043數據集，以Padj<0.05且log2<-1或log2>1為條件篩選肺癌差異表達基因。同時，檢索GeneCards（https://www.genecards.org/）[11]、OMIM（https://omim.org/）[12]、Malacards（https://www.malacards.org/）數據庫，得到肺癌疾病相關靶點，合并去重，輸入UniProt數據庫，對靶點進行標準化。

1.4 蛋白相互作用網絡構建及核心靶點分析

使用Venny2.1.0數據庫（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將固本解毒方藥物靶點與肺癌疾病靶點取交集，交集靶點上傳至STRING數據庫（https://string-db.org/）[13]構建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，物種設置為“Homo sapiens”，可信度>0.9，隱藏孤立蛋白，得到PPI網絡，將PPI網絡TSV文件導入Cytoscape3.8.0軟件進行可視化，并利用CytoNCA插件進行拓撲分析，根據度中心度（DC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC），以大于2倍中位數篩選網絡中的核心靶點[14]。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

利用DAVID6.8數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）[15]對靶基因進行GO和KEGG通路富集分析，GO分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞組 分 （cellular component，CC） 和 分 子 功 能（molecular function，MF）。

1.6 分子對接

從RSCB PDB 數據庫（http://www.rcsb.org/）[16]和ZINC數據庫（http://zinc.docking.org/）[17]下載受體的晶體結構和配體的化學結構，用AutoDock Vina[18]軟件進行分子對接，評價固本解毒方主要活性成分與關鍵靶點的結合強度與活性。結合能<0時配體與受體結合的構象穩定，能量越低其結合的可能性越大，結合能≤-5.0 kcal/mol時成分與靶點具有良好的親和力，結合能≤-7.0 kcal/mol時具有很好的親和力[19]。選擇最低結合能模型通過PyMOL2.4.0軟件進行可視化分析。

1.7 實驗驗證

1.7.1 細胞和動物

人肺腺癌A549 細胞，美國克利夫蘭州立大學Aimin Zhou實驗室提供。SPF級雄性SD大鼠24只，體質量200～250 g，購自中國食品藥品檢定研究院，動物生產許可證號SCXK（京）2017-0005，飼養于北京隆安實驗動物養殖中心，溫度21～25 ℃，相對濕度40%～60%，自由攝食飲水。實驗均經北京隆安實驗動物養殖中心倫理委員會批準（BJLA2020-08）。

1.7.2 藥物、試劑和儀器

固本解毒方（北沙參20 g，桔梗9 g，黃芪30 g，當歸10 g，續斷10 g，骨碎補10 g，牛膝10 g，補骨脂10 g，太子參15 g，半枝蓮20 g、土茯苓20 g，白花蛇舌草15 g，甘草6 g）飲片，購自中國中醫科學院望京醫院中藥房，經王景紅主任藥師鑒定符合2020 年版《中華人民共和國藥典》規定。RPMI1640培養基，中國北京索萊寶科技有限公司，批號31800；0.25%胰蛋白酶、胎牛血清，Hyclone 公司，批號分別為SH30042.01、SH30070.03；M5 HiPer MTT/細胞毒性和細胞增殖檢測試劑盒，中國北京聚合美生物科技有限公司，批號MF837-01；BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白預染Marker，中國北京康為世紀生物科技股份有限公司，批號分別為CW0014S、CW2841S；Goat Anti-rabbit IgG/HRP，中國北京索萊寶科技有限公司，批號SE134；PVDF膜，德國Merck Millipore公司；蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、糖原合成酶激酶（GSK）-3β、p-GSK-3β抗體，美國Cell Signaling Technology公司，貨號分別為4691T、4060T、12456T、9323T；B淋巴細胞瘤-2基因相關X蛋白（Bax），美國Santa Cruz公司，貨號sc-7480；B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2），英國Abcam公司，貨號ab182858。Nis-Elements D 2.30軟件（Nikon），680 型酶標儀（美國Bio-Rad 公司），DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型電轉儀、DYY-6C型電泳儀電源（北京六一儀器廠）。

1.7.3 含藥血清制備及細胞分組

根據人與動物體表面積換算比值[20]計算大鼠每日用藥劑量為原藥材20 g/kg，常規水煎濃縮至含原藥材1.25 g/mL，于4 ℃冰箱保存備用。大鼠隨機分為給藥組和空白組，給藥組給予固本解毒方灌胃，空白組給予等量生理鹽水，每日2次，連續5 d。末次灌胃后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，靜置2 h，3 500 r/min 離心10 min，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，使用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后置于-20 ℃冰箱保存備用。

A549 細胞用含10% 胎牛血清、1% 雙抗的RPMI1640培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗。根據不同劑量固本解毒方含藥血清對細胞存活率的影響，將后續實驗分為正常血清組（10%空白血清）及固本解毒方高、中、低劑量組（10%、5%、2.5%含藥血清）。

1.7.4 MTT實驗檢測細胞存活率

收集生長良好的A549細胞，調整細胞懸液濃度為1×105個/mL，每孔 100 μL，接種于 96 孔板。置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。用正常血清（正常組）和固本解毒方含藥血清（實驗組）處理細胞，繼續培養24 h。吸去上清，加入90 μL新鮮培養液，再加入MTT溶液10 μL，繼續培養4 h。吸棄上清液，每孔加入Formazan溶解液110 μL，置于搖床上，低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀波長490 nm處測量各孔吸光度（OD值）。

1.7.5 Wetern blot檢測蛋白表達

將對數生長期的A549細胞接種于6孔培養板中，分別加入正常血清和10%、5%、2.5%固本解毒方含藥血清，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h后提取總蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入Bax、Bcl2、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β 一抗（均以1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST沖洗3次，每次5 min，加入二抗，室溫搖床孵育2 h，TBST沖洗3次，每次5 min，顯影，凝膠成像系統掃描各條帶灰度值，用Image J軟件進行處理，計算目的蛋白相對表達量。

1.7.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行分析。實驗數據以表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析，多組間兩兩比較采用Dunnett-t法。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 固本解毒方活性成分

篩選得到固本解毒方活性成分237種，其中北沙參8種、續斷8種、骨碎補18種、牛膝20種、黃芪20種、當歸2種、太子參8種、半枝蓮25種、土茯苓14種、白花蛇舌草7種、桔梗7種、甘草92種、補骨脂8種，主要活性成分有kaempferol（山柰酚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、quercetin（槲皮素）、stigmasterol（豆甾醇）、sitosterol（谷甾醇）、eriodictyol（圣草酚）、luteolin（木犀草素）、wogonin（漢黃芩素）、baicalein（黃芩素）、baicalin（黃芩苷）等。

2.2 固本解毒方藥物靶點和肺癌疾病靶點

固本解毒方237種活性成分不重復作用靶點共有889個。GEO數據庫GSE136043數據集中肺癌差異表達基因火山圖見圖1。篩選到1 821個差異表達基因，合并GeneCards、OMIM、Malacards數據庫，共收集到不重復的疾病靶點20 442個。

圖1 GSE136043數據集肺癌差異表達基因火山圖

2.3 蛋白相互作用網絡及核心靶點

固本解毒方與肺癌交集靶點880個。交集靶點PPI網絡見圖2。使用cytoNCA 插件計算DC、BC、CC，以大于2 倍中位數（DC≥79，BC≥2 208.1，CC≥0.5）篩選得到核心靶點AKT1、EGFR、TNF、IL6、STAT3、PIK3CA、mTOR等，見圖3。

圖2 固本解毒方治療肺癌靶點PPI網絡

圖3 固本解毒方治療肺癌核心靶點

2.4 核心靶點GO和KEGG通路富集分析

固本解毒方治療肺癌GO富集分析結果見圖4。其中，BP主要富集在肽基絲氨酸/酪氨酸磷酸化和增殖、凋亡、炎癥反應，CC主要富集在質膜細胞質側的外部成分，MF主要富集在蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸酶活性、ATP結合盒等。KEGG通路富集分析結果見圖5。神經活性配體-受體相互作用、癌癥相關通路、PI3KAkt 信號通路、鈣離子信號通路、HIF-1 信號通路、VEGF信號通路、MAPK信號通路、凋亡相關通路顯著性較好，提示固本解毒方可能通過這些信號通路抑制肺癌。尤其是PI3K-Akt信號通路顯著性好，富集的靶點多，見圖6。

圖4 固本解毒方治療肺癌關鍵靶點GO富集分析

圖5 固本解毒方治療肺癌核心靶點KEGG通路富集分析

圖6 固本解毒方治療肺癌PI3K-Akt信號通路

2.5 分子對接結果

將固本解毒方主要活性成分與關鍵靶點進行分子對接，結合能見表1。固本解毒方主要活性成分與關鍵靶點均有較好的對接效果，其中多個成分與AKT1、PIK3CA的結合能均較低，提示藥物可能通過AKT1、PIK3CA發揮作用。

表1 固本解毒方治療肺癌主要活性成分與關鍵靶點結合能（kcal/mol）

進一步挑選結合能低的最優構象進行可視化，結果見圖7。stigmasterol（豆甾醇）與AKT1 活性位點TYR-175 等形成氫鍵作用力，Inophyllum_E 與PIK3CA 的活性位點ARG-662 等形成氫鍵作用力，Inophyllum_E 與 GSK3β 的 活 性 位 點 PRO-136、VAL-135、TYR-134等形成氫鍵作用力。

圖7 固本解毒方治療肺癌主要靶點與活性成分分子對接示意

主要活性成分與關鍵靶點分子對接結果表明，AKT1、PIK3CA、GSK3β可能是固本解毒方的關鍵作用靶點。

2.6 固本解毒方對A549細胞存活率的影響

與正常組比較，不同劑量（2.5%、5%、10%、20%、40%）固本解毒方含藥血清處理A549細胞24 h，A549細胞存活率受到抑制，并呈一定的劑量依賴性，結果見圖8。為排除固本解毒方含藥血清毒性對細胞的影響，選擇10%、5%、2.5%含藥血清作為高、中、低劑量進行后續實驗。

圖8 固本解毒方對A549細胞存活率的影響

2.7 固本解毒方對肺癌A549 細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl2表達的影響

結合GO 和KEGG 通路富集分析結果，采用Western blot檢測固本解毒方對A549細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl2的影響，結果見圖9。與正常血清組比較，固本解毒方組A549細胞Bax蛋白表達顯著上調，Bcl-2蛋白表達顯著下調，差異均有統計學意義（P<0.01，P<0.001）。

圖9 各組A549細胞Bax、Bcl2蛋白表達免疫印跡

2.8 固本解毒方對肺癌A549 細胞PI3K-Akt 通路蛋白表達的影響

采用Western blot 檢測進一步驗證固本解毒方對A549 細胞 PI3K-Akt 信號通路 Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β 蛋白表達的影響，結果見圖10。與正常血清組比較，固本解毒方組A549 細胞p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β 表達明顯下調（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。表明固本解毒方通過調控PI3K-Akt信號通路治療肺癌。

圖10 各組A549細胞p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達免疫印跡

3 討論

網絡藥理學是以系統生物學為基礎，對藥理學和生物信息學進行結合的產物[21]。與以往的單成分、單靶點思維不同，網絡藥理學認為，藥物在體內的過程是一個復雜的作用網絡，即多成分-多靶點-多途徑作用過程，藥物通過多靶點間的相互作用產生增效減毒效果，符合中醫整體觀念，更適用于對具有復雜特性的中藥復方進行分析[22-23]。

本研究篩選得到固本解毒方活性成分237 種，kaempferol（山柰酚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、quercetin（槲皮素）、baicalin（黃芩苷）等為主要活性成分。現代藥理學研究表明，方中諸藥通過抑制腫瘤細胞本身的增殖和調控腫瘤免疫抑制微環境（tumor immunosuppressive microenvironment，TIM）的穩態來抑制腫瘤的生長和復發[24-26]。山柰酚能抑制A549細胞生長，可能與下調UBF的磷酸化水平影響rDNA的轉錄有關[27]。β-谷甾醇引起G2/M期細胞周期阻滯，誘導A549細胞凋亡[28]。槲皮素是一種可以預防肺癌等多種腫瘤的抗氧化類黃酮化合物，研究表明，其可能通過Stat3/Mcl-1途徑介導肺癌PC9/GR細胞凋亡[29]。黃芩苷通過誘導腫瘤相關巨噬細胞復極化為M1樣巨噬細胞，并促進腫瘤中促炎細胞因子的產生，從而抑制肝細胞癌模型小鼠腫瘤生長[30]。

本研究顯示，固本解毒方治療肺癌的核心靶點有AKT1、 PIK3CA、 EGFR、 TNF、 IL6、 STAT3、mTOR，主要通過PI3K-Akt信號通路，富集在蛋白酪氨酸激酶活性、增殖、凋亡、炎癥反應等過程。這些靶點及通路在中醫藥調節TIM方面發揮重要作用。有研究顯示，肺瘤平膏及其有效組分桔梗皂苷D通過調節PI3K-AKT-mTOR通路改善TDCs脂質異常堆積和抗原呈遞功能，增強機體的抗腫瘤免疫功能，進而發揮抑瘤效應[31-33]。Yim 等[34]發現，桔梗苷通過AMPK/mTOR/AKT信號介導的自噬誘導人肺癌A549細胞的死亡。Li等[35]研究表明，中藥配方通過抑制STAT3信號通路，抑制免疫抑制細胞因子的激活和免疫逃逸以增強免疫反應，顯著抑制黑色素瘤小鼠的腫瘤生長。Bcl-2家族包含促凋亡蛋白及抗凋亡蛋白兩大類，Bax主要通過升高線粒體膜通透性和促進細胞色素C的釋放而起到誘導細胞凋亡作用，而Bcl-2主要通過減少線粒體細胞色素C 的釋放而發揮抗細胞凋亡作用[36-38]。Aghvami等[39]研究表明，苦參堿在急性淋巴細胞白血病B淋巴細胞中上調促凋亡蛋白Bax，同時下調抗凋亡蛋白Bcl-2。髓源性抑制細胞通過激活TGF-β、EGF和HGF信號通路，誘導上皮間質轉化，促進腫瘤轉移[40]。基于血清藥理學方法，Chen等[41]發現扶正抑瘤湯含藥血清通過促進體內IL-2和TNF-α的產生，顯著抑制肝癌細胞的增殖和誘導細胞凋亡，該結果與其以往動物實驗和臨床試驗結果一致，表明血清藥理學是評價扶正固本中藥抗腫瘤作用的一種合理可行的方法。本研究分子對接結果表明，固本解毒方主要活性成分與AKT1、PIK3CA、GSK3β均有很好的結合力。體外實驗結果表明，固本解毒方含藥血清可顯著降低Bcl2、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β表達水平。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學和分子對接方法，分析固本解毒方治療肺癌的作用機制，并利用體外細胞實驗進行了初步驗證，PI3K-Akt信號通路可能是固本解毒方抗肺癌的關鍵通路，可為后續實驗研究提供思路。