microRNA在糖尿病腎病中的作用機制與研究進展

鄒夢林，羅來敏，張桂玲，鄢 艷

(南昌大學 a.第一附屬醫院高新醫院腎內科,南昌 330096； b.第一附屬醫院腎內科，南昌 330006)

microRNA(miRNA)是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長20～25個核苷酸。通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯，從而抑制其靶基因的表達，參與機體各種生理與病理過程的調節，對機體免疫反應及疾病的發生發展與轉歸起重要的調控作用，包括糖尿病腎病(DN)[1-2]。DN是糖尿病最常見最嚴重的慢性微血管并發癥之一，在西方國家已成為導致終末期腎病的主要原因[3]，有文獻[4]報道,在我國住院患者中，糖尿病腎病超腎小球腎炎是導致慢性腎臟病的首要原因。李潔等[5]對miR-192介導的β信號通路進行研究，結果顯示miRNA調控作用可能成為DN一個新的診斷標志及治療靶點。此后，miRNA在DN發病機制中的作用日益受到關注。有研究[6]發現，miRNA對腎小球基底膜和系膜細胞的損傷、足細胞的損傷及腎小管間質纖維化的調控起到了關鍵作用。本文就miRNA在DN中的作用機制及研究進展作一綜述。

1 miRNA的特點及功能

miRNA廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列RNA，本身不具有開放閱讀框架(open reading frame,ORF)；成熟的miRNA 5′端有一磷酸基團，3′端為羥基,3′端可以有1～2個堿基的長度變化，這一特點使它與大多數寡核苷酸和功能RNA的降解片段區別開來；多數miRNA還具有高度保守性、時序性和組織特異性。1993年LEE等[7]在秀麗新小桿線蟲中首次發現miRNA，它在不同生物體的發育、分化、細胞增殖和凋亡途徑中發揮著重要的調節作用。目前已知的抑制靶基因表達有兩種方式：1)與靶mRNA不完全互補的miRNA在蛋白質翻譯水平上抑制其表達(哺乳動物中比較普遍)，有可能影響mRNA的穩定性；2)與靶mRNA互補，這些miRNA的結合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比較常見)[8]。這些結合位點通常都在mRNA的編碼區或開放閱讀框中。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNA也可以調節同一個基因。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA的組合來精細調控某個基因的表達。隨著miRNA調控基因表達研究的逐步深入，miRNA作為疾病的診斷標志及治療靶點的潛在價值也受到人們的日益關注。

2 miRNA參與DN的機制

有研究[9]證實，長期高血糖刺激會導致腎小球肥大、炎癥細胞浸潤、基底膜增厚、腎小球硬化和腎小管萎縮，最終導致腎衰竭。在早期的一項研究中，SUN等[10]通過生信分析及蛋白質印跡法，發現5種miRNA(miR-192、miR-194、miR-204、miR-215和miR-216a)在人體腎臟中較其他器官中高表達，表明它們在腎臟疾病發生發展中有著潛在作用。隨著基因芯片、生信分析、高通量測序等技術的進展，表明miRNA表觀遺傳調節、轉錄后調節在DN發病相關機制中起重要作用[11]。

2.1 參與腎小球基底膜和系膜細胞的損傷

糖尿病腎病主要病理學特點有基底膜增厚、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)積聚、系膜擴張、腎小管間質纖維化、足細胞足突融合及消失等[12]。轉化生長因子β(transforming growth factor-beta1,TGF-β)在糖尿病腎病腎小球系膜細胞肥大和纖維化過程中起重要作用。Smad蛋白家族是最早被證實為TGF-β信號轉導的下游蛋白，它存在細胞質中，可將信號由細胞膜傳至細胞核中。Smad蛋白根據功能不同分為受體激活型(receptor-regulated Smads，R-Smads)、通用介導型(common-partner Smads，Co-Smads)及抑制型(inhibitory Smads，I-Smads)三大類。Smad2與Smad3均屬受體激活型蛋白，它們被TGF-β的Ⅰ型受體磷酸化后可與Smad4形成異源性三聚體復合物，并轉入核內與DNA結合激活DNA轉錄，調節靶蛋白的表達[13]。ZHONG等[14]發現，20周齡2型糖尿病模型db/db小鼠腎小球系膜細胞miR-21表達比同齡小鼠增加了1倍，同時，檢測到其靶基因磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue,PTEN)、Smad7表達減少，TGF-β1、Smad3和NF-κB 水平升高并伴有系膜細胞纖維化和肥大。然而，通過基因敲除或予以反miR-21寡核苷酸后PTEN及Smad7表達增加，TGF-β1、Smad3和NF-κB水平均下降，提示miR-21可能通過抑制PTEN及Smad7表達激活TGF-β/Smad3和NF-κB信號通路進而導致腎小球系膜細胞增殖、纖維化。這與MCCLELLAND等[15]研究一致。

DESHPANDE等[16]研究發現，miR-192在鏈脲菌素(streptozocin,STZ)誘導的1型和2型糖尿病小鼠腎小球中的表達均高于對照組，且TGF-β或高糖(high glucose,HG)刺激也能增加miR-192在小鼠系膜細胞(mouse mesangial cells，MMC)和人MC中的表達。有文獻[17]報道，miR-192通過抑制鋅指E盒結合蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)及鋅指E盒結合蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)的表達，繼而導致下游Ⅰ型膠原蛋白α2(type 1 collagen α2，Col1α2)和Ⅳ型膠原蛋白α1(type 4 collagen α1，Col4α1)沉積。KATO等[6]還證實miR-192通過抑制ZEB1和ZEB2的表達，增加腎小球系膜細胞中其他miRNA的表達，例如miR-216a、miR-217和 miR-200b/c增加產生放大電路，進一步促進膠原蛋白的沉積。DESHPANDE等[18]發現與野生型小鼠相比，miR-192基因敲除小鼠和miR-192抑制劑治療的小鼠腎小球肥大、纖維化都較輕。有報道[19]顯示，抗癌藥物小劑量紫杉醇，通過下調miR-192，可以預防殘腎模型的腎纖維化。另，在腎缺血再灌注模型中，使用基因敲除手段，發現小鼠miR-192水平較低，而miR-192水平較低的小鼠存活率較高[20]。表明抑制miR-192的水平對治療腎臟疾病是有益的，這也為治療DN提供新的方向。KATO等[21]研究發現，經TGF-β誘導的小鼠系膜細胞中miR-216a和miR-217表達上調，它們都是通過抑制靶向基因PTEN的表達來激活PI3K/AKT信號通路，導致系膜細胞肥大、增生。miR-200家族成員根據基因組結構被分成miR-200a、miR-200b和miR-200c。它們位于非編碼RNA的內含子中，當E-box上調時，可增加miR-200家族的表達；miR-200家族通過作用于Fog2來激活PI3K信號通路，導致腎細胞肥大和纖維化[22]。

2.2 參與腎小球足細胞損傷

在DN早期，會出現足細胞足突融合等改變。隨著DN的進展，足細胞會凋亡與脫落，導致大量蛋白尿，而蛋白尿的出現可進一步加重足細胞的損傷，由此形成惡性循環，最終導致終末期腎臟病。ZHDANOVA等[23]選擇性敲除小鼠Dicer基因(調控足細胞miRNA生成的關鍵基因)，小鼠出現大量蛋白尿、病理變化，足細胞凋亡、腎小球硬化等。這提示miRNA對維持足細胞正常功能至關重要。有研究[24]表明，miR-29c在DN患者足細胞中升高，足細胞中過表達miR-29c可導致炎癥細胞因子，如IL-1、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的升高。然而，用其抑制劑抑制miRNA-29c表達可以降低足細胞中的炎癥細胞因子。這表明miRNA-29c可能通過增加炎癥因子的表達參與DN的發生發展。LONG等[25]實驗發現，在2型糖尿病db/db小鼠腎小球、HG處理的小鼠內皮細胞和足細胞中，miR-29c均出現上調，且miR-29c通過靶向抑制Spry1表達，激活Rho激酶，參與DN患者ECM沉積和足細胞凋亡，予以反義寡核苷酸沉默miR-29c基因后，可抑制DN患者腎臟內皮細胞和足細胞凋亡，減少患者蛋白尿和ECM沉積。LEE等[26]發現，miR-146a在糖尿病腎病患者足細胞中表達明顯減少，miR-146a水平較低的患者與對照組相比，腎功能明顯下降得更快；該作者還發現，miR-146a表達下降，直接導致其靶基因Notch-1和ErbB4的表達上調。正常情況下，miR-146a可以抑制ErbB4信號傳導，而DN患者可以通過TGF-β1信號通路降低miR-146a表達，從而激活ErbB4信號轉導。使用ErbB4受體阻滯劑厄洛替尼治療后，DN患者蛋白尿進展緩慢，腎小球損傷較前減輕。此外，WAN等[27]研究表明，miR-146a表達的增加可以抑制DN患者的炎癥反應和氧化應激。

2.3 參與腎小管間質纖維化

腎小管間質纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)是評估腎功能衰竭嚴重程度的重要指標，因此闡明TIF在DN中的發病機制具有重要意義。有研究[28]表明，miR-34a-5p可以通過靶向調節沉默信息調節因子2相關酶1(sirtuin-1，SIRT1)，導致DN患者腎小管間質纖維化。有研究[29]顯示，在DN小鼠腎組織中，miR-34a-5p水平上調，導致其下游分子SIRT1表達下降，然而，SIRT1低表達可導致TGF-β1表達明顯增加。這提示miR-34a-5p/SIRT1可能通過TGF-β1信號通路加重DN的TIF進展。除TIF外，miR-34a-5p還可以通過抑制BCL-2和BCL-W(BCL家族抗凋亡成員)蛋白的產生，增加硬脂酸誘導的胰島β細胞脂質毒性[30]。因此，減少miR-34a-5p表達可能是防治TIF和胰島β細胞脂毒性的有效策略。另外，在研究糖尿病大鼠的miRNA表達譜時，ZANCHI等[31]發現，miR-184在晚期DN大鼠腎臟中的表達顯著上調，并且主要集中在受損的近端小管區域，同時出現脂肪磷酸酶3(llipophosphatase 3，LPP3)的表達減少和間質3型膠原的增多。巧合的是，他們還發現大鼠腎臟連續切片中LPP3染色減少，既往研究[32]證實，LPP3的減少會增加溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)的表達，進一步導致腎小管間質纖維化。

一些miRNA，包括miR-192，在嚴重或晚期DN模型中被下調，如糖尿病Apoe基因缺陷小鼠[33]。DN晚期腎小管壞死/凋亡，可導致腎小管上皮細胞miRNA水平降低。WANG等[33]觀察到，在HG或TGF-β1處理下，小鼠近端腎小管上皮細胞中miR-192表達下降，同時檢測到E-鈣黏素(E-cadherin)降低。E-cadherin是一種鈣依賴性的跨膜蛋白，參與細胞與細胞間黏附，它廣泛分布于人和動物的各類上皮細胞，其中包括腎小管上皮細胞，在維持細胞的極性和完整性等方面起著重要作用。當E-cadherin減少時，可出現腎小管上皮細胞損傷、腎間質纖維化。

3 miRNA可作為DN的分子標志物和治療靶點

隨著miRNA檢測和定量技術的迅速發展，包括基因芯片、定量PCR和高通量測序，開發miRNA作為人類疾病的潛在生物標記物和治療靶點成為研究熱點。miRNA在人體血漿及尿液中穩定存在，血液中存在的miRNA是癌癥、組織損傷和心力衰竭的敏感生物標志物[34-35]。TAYEL等研究[36]發現，與健康對照組相比，DN患者中的miR-126和miR-192表達下調，進一步分析發現，miR-126和miR-192表達與肌酐水平及尿白蛋白肌酐比值(ACR)呈負相關。此外，MENG等[37]研究表明，尿液中miR-199-3p的降低可以從糖尿病患者和健康對照中篩查出DN患者。故除了miR-192，其他關鍵性的miRNA如miR-21、miR-200家族成員及miR-29b/c的靶向抑制或過表達，在DN和其他腎臟疾病的體外和體內模型中顯示出一定的應用前景。

K?LLING等[38]研究認為，在DN小鼠腎臟中，miR-21是表達較多的miRNA之一，體內外抑制這種miRNA可以降低系膜基質擴張、間質纖維化、巨噬細胞浸潤、足細胞丟失、蛋白尿以及炎癥和纖維化分子的表達。miR-21拮抗劑可改善DN小鼠腎臟的結構和功能，是治療糖尿病并發癥的有效藥物。CIVANTOS等[39]發現，作為二肽基肽酶-4(Dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)抑制劑的西格列汀，通過下調miR-200a/Keap-1/Nrf2信號通路,減輕DN大鼠miRNA介導的氧化應激。KANG等[40]研究發現，阿曲生坦可以降低miRNA-199b-5p的表達，增加klotho水平，klotho是一種抗衰老的單通道蛋白質，可以調控胰島素敏感性。miRNA-199b-5p介導的血清klotho水平升高，可能是阿曲生坦預防DN患者腎小管損傷的機制之一。提示miRNA可作為DN分子標志物和治療靶點。

4 結語與展望

miRNA在各種疾病中的研究越來越廣泛,其重要價值已逐漸被科學家們所證實。其參與疾病的發生、發展過程，可作為疾病監測、診斷、治療的新靶點。miRNA通過參與腎小球系膜細胞肥大、足細胞損傷、腎小管間質纖維化等導致DN的發生及進展。隨著miRNA在DN研究領域的不斷深入，期待miRNA作為敏感及特異的生物標志物早日在臨床用于DN早期診斷及病情監測。