仙芪消渴飲治療糖尿病腎臟病的潛在作用機制

劉夢陽，李海勇，郭燕，張富賡，劉征堂

1.中國中醫科學院西苑醫院老年病科（北京100091）；2.蘇州市中西醫結合醫院康復科（蘇州215101）；3.北京香山社區衛生服務中心中醫科（北京100093）；4.天津市環湖醫院藥劑科（天津 300350）

糖尿病腎臟病（diabetic kidney disease，DKD）是由糖尿病導致的慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD），是目前引起終末期腎臟疾病（End-stage renal disease，ESRD）最主要的原因[1]。文獻報道我國2 型糖尿病患者DKD患病率為20%～40%[2-3]；與不合并DKD的糖尿病病人相比，DKD病人死亡率更高。

糖尿病腎臟病屬于中醫“水腫”、“關格”范疇。中國中醫科學院西苑醫院老年病科自2型糖尿病作為臨床路徑以來，通過不斷梳理，經層次聚類和復雜網絡分析得到：糖尿病由早中期進展至晚期，病性由實轉虛、病位由上中二焦轉向下焦，核心處方由以清利濕熱、涼血散瘀、疏達上中二焦郁滯的“桑蠶飲”（科室另一自擬方）過渡到以補腎填精、利濕化濁為法的六味地黃湯類方。科室自擬仙芪消渴飲，針對糖尿病腎功能受損這一并發癥療效顯著[4]。

網絡藥理學以網絡靶標為核心，對藥物與疾病的機制性關聯進行系統化、可視化地揭示解構；因其研究思路和學科特點與中醫藥整體觀念不謀而合，故近年來已被廣泛應用于中藥研發[5-6]。分子對接是將配體分子置于受體分子活性位點區域并通過幾何互補、能量互補等原則找到二者的最佳結合模式[7]。本研究擬借助網絡藥理學和分子對接法探索仙芪消渴飲治療糖尿病腎臟病的核心藥效團及其作用機制，以期為優化臨床路徑、經典名方再開發提供循證醫學依據。

1 材料與方法

1.1 活性成分收集和靶點預測

應用數據庫TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，依次搜索仙芪消渴飲中的10味中藥得到各自的活性成分；再通過文獻挖掘予以補充后查詢出相應靶點信息。

1.2 確定DKD相關靶點

1.2.1 提取基因芯片樣本信息 登錄GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），輸入“diabetic kidney disease”進行檢索，篩選出同時含有DKD 腎組織和對照腎組織的人源基因芯片并從中提取樣本數據。

1.2.2 獲取差異基因（DEGs）序列 首先，通過Perl腳本將DKD 相關基因芯片的樣本數據分組條理化；之后在R3.6.2 環境下，按照P.Val＜0.05、|log2（FC）|＞0.5 的條件依托Bioconductor（www.bioconductor.org/）功能包篩選出DKD 腎組織較對照腎組織顯著上調、下調的差異基因序列，合為DKD 相關靶點；同時繪制相應的熱圖和火山圖。

1.3 創建“中藥復方成分-疾病-靶點網絡”

利用韋恩圖（Venn Diagram）確定仙芪消渴飲治療DKD的潛在作用靶點，即二者靶點之交集。通過Cyto?scape3.7.2軟件將“中藥復方成分-疾病-靶點網絡”可視化。

1.4 分析靶蛋白互作網絡

利用Cytoscape3.7.2 插件Bisogenet 構建蛋白互作網絡（protein-protein interaction，PPI）；CytoNCA 插件對其進行拓撲分析，先后點擊Centralities 下“degree（DC）”、analyze、DC＞61 和Centralities 下“Betweeness（BC）”、analyze、BC＞600，得到PPI核心網絡。

1.5 挖掘PPI核心網絡功能模塊

利用MCODE插件的聚類算法尋找基因簇，從而實現對PPI 核心網絡的模塊化分析。在操作過程中分別設定“Degree Cutoff”、“Node Score Cutoff”、“K-Core”和“Max.Depth”，依次為2、0.2、5、100。

1.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

運行R3.6.2軟件以P＜0.05作為靶基因篩選條件，借助Bioconductor 功能包實現GO 和KEGG 分析；同時根據P.adjust分別繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.7 分子對接

選取PPI 核心網絡中Degree 參數大于中位數且與顯著性較強的富集分析結果密切相關的重要靶點（HSP90AA1、CDK2、ESR1、MDM2）作為蛋白受體，相應的藥物成分（槲皮素、熊竹素、食脂素、木犀草素）作為配體。分別應用PDB（http://www.rcsb.org/）和Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）篩選出靶點蛋白三維結構和藥物成分二維結構。運用PyMol 軟件刪除靶點蛋白三維結構上的水分子及小分子配體并保存為pdb 格式。運行ChemBio3D 軟件將藥物成分二維結構轉換為三維結構并對其進行優化（選擇“calcula?tions”-“MM2”-“Minimize Energy”-“Run”），保存為mol2 格式。應用AutoDock 軟件將二者轉化為PDBQT格式并確定活性口袋。最后使用Vina軟件進行分子對接，利用Pymol軟件將對接結果可視化。

2 結果

2.1 仙芪消渴飲活性成分收集和靶點預測結果

經篩選仙芪消渴飲各中藥所含活性成分分別為山藥16 個、山茱萸20 個、熟地2 個、牡丹皮11 個、茯苓15個、澤瀉10 個、黃芪20 個、仙靈脾（淫羊藿）23 個、北沙參8個、甘草92個；在剔除重復項后共得到193個活性成分，按照OB 值由高至低排序后選取前20 項結果展示見表1。通過TCMSP數據庫搜索后共得到潛在靶點245個，部分靶標展示見表2。

表1 仙芪消渴飲部分活性成分基本信息Table 1 Active ingredients in Xianqixiaoke Decoction

表2 仙芪消渴飲部分靶點基本信息Table 2 Targets of Xianqixiaoke Decoction

2.2 DKD相關靶點

2.2.1 基因芯片篩選結果與樣本數據 研究共納入樣本69例，其中實驗組（DKD 腎組織）19 例、對照組50例；源自GEO數據庫DKD基因芯片（編號：GSE30122）。

2.2.2 差異基因（DEGs）序列的確定 經篩選共得到638個差異基因，將該差異基因序列確定為DKD 相關靶點，所繪制的差異熱圖，見圖1（圖中僅顯示前20 位上調和下調基因）和差異火山圖，見圖2。

圖1 差異基因熱圖Figure 1 Heat map of DEGs

圖2 差異基因火山圖Figure 2 Volcano plot of DEGs

2.3 “中藥復方成分-疾病-靶點網絡”構建結果

仙芪消渴飲治療DKD 的潛在作用靶點共24個，見圖3。

圖3 藥物靶點-疾病靶點韋恩圖Figure 3 Venn diagram of drug target-disease target

圖4 為經Cytoscape3.7.2 軟件可視化處理后的“中藥復方成分-疾病-靶點網絡”圖，即中藥復方調控網絡圖，它共包含124個節點、167條邊：其中24個天藍色三角形節點代表24 個靶基因；另外100 個不同顏色的節點代表來自不同中藥且與靶基因相關聯的活性成分，綠色代表“甘草”、黃色代表“黃芪”、粉色象征“牡丹皮”、灰色視為“山藥”、紫色表示“山茱萸”、棕色視為“仙靈脾”、紅色則象征多種中藥共同所有；“多藥共有”成分集中在槲皮素（quercetin）為甘草、仙靈脾、黃芪、牡丹皮、北沙參共有，山萘酚（kaempferol）為甘草、仙靈脾、黃芪、牡丹皮共有，芒柄花黃素（formononetin）、異鼠李素（isorhamnetin）、毛蕊異黃酮（calycosin）、熊竹素（jaranol）均為甘草、黃芪共有，常春藤甙元（heder?agenin）為黃芪、茯苓共有，豆甾醇（stigmasterol）為山茱萸、熟地、北沙參、茯苓共有，食脂素（DFV）為甘草、仙靈脾共有。

圖4 中藥復方調控網絡圖Figure 4 Interaction network diagram of Chinese herbal compound

2.4 靶蛋白互作網絡分析

在Bisogenet 插件中導入仙芪消渴飲與DKD 共有的24個蛋白基因，初步得到一個包括1 761個節點、36 776 條邊的PPI 網絡；運行CytoNCA 插件先后按DC＞61、BC＞600 對其進行拓撲分析，分別創建出包括378個節點、13 690條邊和包括44個節點、454條邊的兩個新的子網絡，后者即PPI核心網絡，見圖5。

圖5 PPI 網絡拓撲分析Figure 5 Network topology analysis of PPI

2.5 PPI核心網絡模塊化分析

通過MCODE插件圍繞PPI核心網絡挖掘提煉出2 個關鍵的功能模塊，見圖6。

圖6 PPI核心網絡的2個功能模塊Figure 6 Two functional modules of PPI core network

2.6 富集分析

GO分析具體結果見圖7～9：功能模塊1BP共涉及90 個條目，主要包括蛋白酶體介導泛素依賴的蛋白質分解代謝過程（proteasome?mediated ubiquitin?depen?dent protein catabolic process）、蛋白酶體蛋白質分解代謝過程（proteasomal protein catabolic process）、細胞對胞外刺激的反應（cellular response to extracellular stimu?lus）、有絲分裂細胞周期中的G1/S信號轉換機制（G1/S transition of mitotic cell cycle）、對由IRE1介導的未折疊蛋白反應的調控（regulation of IRE1?mediated unfolded protein response）；CC共涉及17個條目，主要包括COP9信號復合體（COP9 signalosome）、黑色素體（Melano?some）、色素粒（pigment granule）、黏附斑（focal adhe?sion）、細胞-基底黏著連接（cell ?substrate adherens junction）、細胞-基質間連接（cell?substrate junction）、cullin-環泛素連接酶復合物（cullin?RING ubiquitin li?gase complex）；MF 共涉及12 個條目，主要包括細胞粘附分子結合（cell adhesion molecule binding）、泛素蛋白連接酶結合（ubiquitin protein ligase binding）、泛素樣蛋白連接酶結合（ubiquitin?like protein ligase binding）、參與蛋白質折疊的蛋白質結合（protein binding involved in protein folding）、錯誤折疊蛋白質結合（misfolded pro?tein binding）。

圖7 GO生物過程分析（前20）Figure 7 GO biological process analysis（top 20）

功能模塊2BP得到535條結果，主要包括對未折疊蛋白的反應（response to unfolded protein）、DNA 損傷檢控點（DNA damage checkpoint）、DNA 完整性檢控點（DNA integrity checkpoint）、細胞周期過程的負向調節（negative regulation of cell cycle process）；CC 共涉及36個條目，主要包括富含纖維膠凝蛋白-1的顆粒腔（fico?lin?1?rich granule lumen）、分泌顆粒腔（secretory gran?ule lumen）、細胞質囊腔（cytoplasmic vesicle lumen）、囊泡腔（vesicle lumen）；MF共涉及65個條目，主要包括無序域特異性結合（disordered domain specific binding）、泛素蛋白連接酶結合（ubiquitin protein ligase binding）、泛素樣蛋白連接酶結合（ubiquitin?like protein ligase binding）。

KEGG 分析結果，見圖10：功能模塊1 共富集6 條通路，主要包括細胞分裂周期（Cell cycle）、泛素介導的蛋白水解作用（Ubiquitin mediated proteolysis）、PI3KAkt信號通路（PI3K?Akt signaling pathway）；功能模塊2共富集28 條通路，主要包括前列腺癌（Prostate can?cer）、內質網蛋白加工（Protein processing in endoplas?mic reticulum）、甲狀腺激素信號通路（Thyroid hormone signaling pathway）、細胞分裂周期（Cell cycle）、PI3KAkt信號通路（PI3K?Akt signaling pathway）。

圖8 GO細胞組分析（前20）Figure 8 GO cellular component analysis（top 20）

圖9 GO分子功能分析（前20）Figure 9 GO molecular function analysis（top 20）

圖10 KEGG分析（前20）Figure 10 KEGG analysis（top 20）

2.7 分子對接驗證

如表3 所示，仙芪消渴飲藥效分子與蛋白靶標（HSP90AA1、CDK2、ESR1、MDM2）的最低結合能均小于0，說明配體與受體均可以自發結合、形成最佳復合體。仙芪消渴飲可通過調節以上靶標發揮治療作用。分子對接模式，見圖11。

圖11 仙芪消渴飲分子對接模式圖Figure 11 Molecular docking diagram of Xianqixiaoke Decoction

表3 仙芪消渴飲有效成分分子對接結果Table 3 Molecular docking results of active ingredients of Xianqixiaoke Decoction

3 討論

仙芪消渴飲共涉及193 個活性成分、24 個關鍵靶點。對從PPI 核心網絡中挖掘出的2 個模塊進行富集分析剔除重復項后發現：GO 分析共得到588 個生物學過程、47 個細胞組分、72 個分子功能；KEGG 分析共富集30 條通路。由此可見，仙芪消渴飲通過多成分、多靶點、多通路對糖尿病腎臟病進行干預。

從中藥復方調控網絡可以看出，仙芪消渴飲中與作用靶點密切相關的核心藥物為甘草、仙靈脾、黃芪、山藥。據文獻報道甘草及其有效成分可對糖尿病腎臟病起到一定防治作用：甘草的醇和水提取物都能對抗高糖刺激所誘導的腎小球系膜細胞過度增殖并易化腎小球系膜細胞基質降解[8]；甘草酸不僅能抑制氧化應激、減少腎臟細胞凋亡，還可通過調控轉化因子-β1/Smads 信號通路抑制高糖誘導的細胞外基質蛋白在腎小球和腎小管間質中的過度沉積，延緩DKD 進展[9-10]；而甘草次酸在降低血糖、血脂、改善腎功能的同時下調腎組織層黏連蛋白、α-平滑肌蛋白的表達從而改善系膜區纖維化及腎小管萎縮[11]。仙靈脾及其有效成分可通過上調內皮NO合成酶發揮松弛血管、抑制血小板聚集和在一定程度上遏止血管平滑肌細胞過度增殖的作用[12]，還能明顯改善慢性腎功能不全的癥狀與相關生化指標，其作用機制可能為①通過上調腎組織中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平，下調丙二醛水平，減輕氧化應激損傷；②通過下調白介素1β、白介素6及單核細胞趨化蛋白-1水平，下調炎癥反應水平；③通過下調轉化生長因子β、血管內皮生長因子、磷酸化p65 表達，阻止腎組織纖維化；④下調caspase-3 表達，抑制腎組織細胞凋亡[13]。目前已證實黃芪有利于糖尿病病人糖原合成、改善胰島素抵抗，使機體血糖維持穩定；在此基礎上，楊麗等[14]研究發現黃芪可改善腎組織免受過度表達的內皮素-1 和轉化生長因子β1 的破壞作用，從而抑制腎小球硬化及基質堆積；宋恩峰等[15]研究發現黃芪能抑制2型糖尿病腎病大鼠的腎臟肥大及腎臟局部腫瘤壞死因子-α和血管內皮生長因子表達，從而減少蛋白尿。山藥及其有效成分不僅增加胰島素分泌、改善受損胰島β細胞功能，還對腎功能有一定保護作用，其機制可能與抑制高糖激活的醛糖還原酶/P38絲裂原活化蛋白激酶/環磷腺苷效應元件結合蛋白信號通路有關[16]。

磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide 3 Kinese/Protein KinaseB，PI3K/AKT）信號通路參與調控細胞的生長、增殖、凋亡、分化[17]。PI3K 被激活后轉變成第二信使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3進而將AKT 活化為磷酸化AKT（p-AKT），p-AKT 可通過阻斷促凋亡分子Bad 與Bcl-2/Bcl-xL 結合而抑制細胞凋亡[18]。研究表明在糖尿病腎病進程中，通過調節PI3K/Akt 通路活性，不僅能夠改善腎臟足細胞表型、減輕足細胞損傷，還能在一定程度上抑制系膜細胞增生，[19]。

研究證實，亞臨床甲狀腺功能減退是糖尿病腎病的獨立危險因素[20]。伴有亞臨床甲狀腺功能減退的老年糖尿病病人糖尿病腎病發生率更高，并與促甲狀腺素水平呈正相關；適度補充左旋甲狀腺素片，可減少蛋白尿，讓糖尿病腎病進程減緩。[21]

泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome-system，UPS）是一種能量依賴性、高度選擇性地調控蛋白質降解的重要系統[22]，又稱泛素蛋白酶體通路。研究發現絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1泛素化降解增加可使絲裂原活化蛋白激酶通路脫磷酸化減少、磷酸化增強，導致該通路持續活化、腎臟損傷加重，由此提示UPS參與了糖尿病腎病的發生[23]。

在GO 功能分析結果中，“IRE1介導的未折疊蛋白反應的調節”“對未折疊蛋白的反應”等條目均與內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）密切相關。內質網是細胞內的重要細胞器，參與各種蛋白的加工合成。在高血糖、氧化應激、脂質代謝障礙狀態下未折疊蛋白增多，當超過內質網的處理能力時導致ERS 從而誘發未折疊蛋白反應[24]。IRE1為內質網Ⅰ型跨膜蛋白，ERS發生時IRE1α磷酸化，一方面通過激活轉錄因子XBP-1S，誘導內質網分子伴侶GRP78/CHOP 的表達，增加蛋白質的折疊能力，恢復內質網正常功能，促進細胞生存；另一方面，持續的ERS可啟動IRE1α-JNK通路介導細胞凋亡[25-26]。此外，相關研究表明與靶蛋白相結合的可能藥效分子槲皮素、熊竹素、食脂素、木犀草素均具有一定腎臟保護作用。槲皮素不僅能調節血糖還可減輕腎小球足細胞損傷[27]；而其通過抑制高糖引起的氧化應激來保護腎單位的機制與木犀草素有異曲同工之妙[28-29]。熊竹素作用于細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2），CDK2表達異常與腎小球系膜細胞增殖、腎小球硬化有關[30]。食脂素可與雌激素受體（ESR1）結合，借助激素發揮調節腎素-血管緊張素系統、改善腎臟缺血狀態、減輕炎性反應、抗凋亡、維持線粒體穩態等功效[31]。

4 結論

本研究解析了仙芪消渴飲治療糖尿病腎臟病是通過多成分、多靶點、多通路起效的可能作用機制，認為其核心藥效團主要通過泛素-蛋白酶體系統、內質網應激、PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路等途徑發揮腎臟保護作用，進而為提高臨床療效及經典名方再開發提供了循證醫學支撐。

（利益沖突：無）