整聯蛋白依賴的Akt激活在內皮細胞鋪展中的作用

周海燕，游婧璨，陳妮，鄧鑫，李永杰，王立群

1.西南醫科大學藥物研究中心（瀘州646000）；2.西南醫科大學藥學院心血管藥理系（瀘州 646000）

血管新生是指在原有血管結構上長出新血管并形成血管網的生物學行為，其在胚胎發育、傷口愈合、腫瘤生長與轉移等多種生理和病理過程中發揮重要作用[1]。內皮細胞-細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）的相互作用以及由此介導的細胞黏附和鋪展是血管新生的始動環節[2-3]。而內皮細胞鋪展的分子機制仍未完全闡明。

整聯蛋白又稱整合素，是表達于細胞表面的ECM受體，介導細胞與細胞外基質以及細胞與細胞之間的相互識別和粘附。磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidyl ino?sitol 3-kinase，PI3K）-Akt 是ECM-整聯蛋白激活的重要信號通路之一，在細胞代謝、細胞生長、細胞存活和細胞運動等過程中發揮重要調節功能[4-5]。研究表明PI3K-Akt 信號通路在ECM-整聯蛋白誘導的上皮細胞[6]，成纖維細胞[7]以及癌細胞[8]鋪展中均起關鍵作用。然而，PI3K-Akt激活對內皮細胞鋪展的影響仍不清楚。

纖維連接蛋白（Fibronectin，FN）是ECM 的重要組成部分，也是維持血管結構完整性的關鍵蛋白[9]。大量研究表明，FN及其受體在胚胎發生和血管發育中起著重要作用，FN基因缺失的小鼠伴有嚴重的血管發育障礙并在胚胎期死亡[10]。基于FN穩定血管結構，保護血管的生理作用，其在細胞與ECM 的相互作用研究中被廣泛應用。因此，本研究將人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）接種于FN上，以研究Akt信號通路對內皮細胞鋪展的影響，從而揭示內皮細胞鋪展的潛在分子機制，為臨床上治療血管新生障礙性疾病提供新的靶點與策略。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVECs（批號：#8000）和內皮細胞培養基（批號：#1001）購自ScienCell 公司（美國）；FN（批號：F2006）購自Sigma公司（美國）；磷酸化Akt抗體（批號：#4060）和總Akt抗體（批號：#4691）購自Cell Signaling Technology公司（美國）；辣根過氧化物酶-山羊抗兔IgG（批號：A0208）、PI3K-Akt通路抑制劑LY294002（批號：S1737）和渥曼青霉素（Wortmannin）（批號：#S1952）購自上海碧云天生物技術有限公司；RGDS和RGES由上海昕浩生物科技有限公司合成。

1.2 細胞培養

HUVECs 培養于含5%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素以及1%內皮生長因子添加劑的內皮細胞培養基中，第3～10代的細胞用于實驗。

1.3 細胞鋪展

將FN（10 μg/mL）或PBS 加入24 孔板中，4 ℃鋪板過夜，PBS 清洗3 三次，5%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h，PBS 再次清洗3 次后，接種HUVECs，加入無血清培養基繼續培養30、60、90、120、180和240 min；在有些實驗中，分別利用LY294002（50 μM）和渥曼青霉素（1 μM）或RGDS（200 μM）和REGS（200 μM）預處理HU?VECs 30 min，再將HUVECs 接種到預先鋪有FN 的24孔板中培養120 min，細胞拍照，使用ImageJ 軟件計算細胞面積，以評價細胞鋪展。

1.4 免疫印跡

將FN（10 μg/mL）或PBS加入6孔板中，4 ℃鋪板過夜，PBS清洗3次，5%胎牛血清白蛋白室溫下封閉1 h，PBS 再次清洗3 次后，接種HUVECs，加入無血清培養基繼續培養30、60、90、120、180和240 min；在有些實驗中，分別利用LY294002（50 μM）和渥曼青霉素（1 μM）或RGDS（200 μM）和REGS（200 μM）預處理30 min后，再將HUVECs接種到FN包被的6孔板中培養1 h，提取細胞總蛋白，蛋白樣品通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入抗-磷酸化Akt 抗體（1∶1 000）或抗-總Akt 抗體（1∶1 000），4°C 孵育過夜，用含0.1%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌之后，加入辣根過氧化物酶-山羊抗兔IgG 室溫下孵育1 h，進一步洗滌之后，加入ECL 化學發光液，曝光顯影，使用ImageJ 軟件分析條帶灰度值。

1.5 統計學分析

采用SPSS19.0 軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，采用單向方差分析（One-Way ANOVA）對多組間進行比較后，進行Post Hoc 檢驗，LSD 法比較兩組間差異，以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FN介導內皮細胞鋪展

在本研究中，我們首先評價了FN對內皮細胞鋪展的影響。結果顯示：當HUVECs 接種于PBS上時，細胞的鋪展面積在240 min內幾乎無變化；而當HUVECs接種于FN上時，細胞的鋪展面積以時間依賴的方式逐漸增加，在120 min 時達到峰值，并且在各個時間點都顯著高于PBS組，P<0.01，差異有統計學意義（圖1），表明FN顯著促進內皮細胞鋪展。

圖1 FN對細胞鋪展的影響Figure 1 The effects of FN on cell spreading

2.2 FN 通過激活PI3K-Akt 信號通路介導內皮細胞鋪展

為了探究內皮細胞鋪展的潛在分子機制，我們檢測了FN 對Akt 磷酸化水平的影響。結果顯示：當HU?VECs接種于PBS上，Akt的磷酸化水平在120 min內基本無變化；而當HUVECs 接種于FN 上15 min，Akt 的磷酸化水平與對照組相比增加了93.8%，并呈現時間依賴性的升高，60 min時達到峰值，在各個時間點都顯著高于PBS組，P<0.05，差異有統計學意義（圖2），表明FN介導Akt 激活。隨后，我們分別利用PI3K-Akt 信號通路抑制劑LY294002 和渥曼青霉素預處理HUVECs 30 min，再將其接種于FN 包被的24 孔板中，Western blot的結果顯示：LY294002 和渥曼青霉素都顯著抑制了Akt的磷酸化，P<0.05，差異有統計學意義（圖3A，B）。而計算細胞鋪展面積，發現與FN組相比，LY294002和渥曼青霉素預處理組細胞鋪展面積都顯著降低，差異有統計學意義，P<0.05（圖3C，D），表明FN通過PI3KAkt信號通路介導內皮細胞鋪展。

圖2 FN介導Akt激活Figure 2 FN induces Akt activation

圖3 FN通過PI3K-Akt信號通路介導細胞鋪展Figure 3 FN induces endothelial cell spreading through PI3K-Akt signaling pathway

2.3 內皮細胞鋪展需要整聯蛋白依賴的Akt激活

整聯蛋白是表達于細胞表面的ECM 受體，ECM-整聯蛋白的相互作用激活細胞內多種信號傳導通路。為了明確FN 介導的Akt 激活是否需要整聯蛋白，我們檢測了整聯蛋白抑制劑RGDS 短肽或對照短肽RGES對Akt 磷酸化水平的影響，結果發現：RGDS 顯著抑制了FN介導的Akt磷酸化，RGDS組Akt磷酸化水平減少了66.1%，P <0.05，差異有統計學意義；而對照短肽RGES對FN介導的Akt激活無顯著影響（圖4），表明FN介導的Akt 激活是整聯蛋白依賴的。為了進一步探究整聯蛋白依賴的Akt激活對內皮細胞鋪展的影響，我們檢測了整聯蛋白抑制劑RGDS 短肽或對照短肽RGES預處理后，細胞鋪展面積的變化，結果顯示：與FN組相比，RGDS預處理組，細胞鋪展面積顯著降低，差異有統計學意義，P<0.05（圖5），表明整聯蛋白依賴的Akt激活對內皮細胞鋪展是必須的。

圖4 整聯蛋白抑制劑RGDS對FN介導Akt激活的影響Figure 4 The effects of RGDS（integrin inhibitor）on FN-induced Akt activation

圖5 FN通過整聯蛋白介導細胞鋪展Figure 5 FN induces endothelial cell spreading through integrins

3 討論

越來越多的證據表明，ECM 除了為細胞提供結構性支持外，在調控細胞粘附、鋪展、遷移和存活等過程中也發揮關鍵作用[11]。FN 是細胞外基質中最早發現的非膠原糖蛋白，其功能之一是作為基底膜的組成部分調控血管網絡的形成，因此對內皮細胞的生理和病理生理過程有重要影響[10]。本研究首先探討了FN 對內皮細胞鋪展的影響，結果發現FN顯著促進內皮細胞鋪展。之前的研究表明FN 可誘導膠質母細胞瘤細胞[12]、NIH3T3 細胞[13]和纖維母細胞瘤細胞[14]等多種細胞的鋪展，這與我們的研究結果一致。并且有文獻報道：細胞在FN 上鋪展的早期步驟主要分為初步黏附期，細胞面積快速增長期以及緩慢鋪展期三個階段[15]，結合我們的實驗結果可以看出，對HUVECs而言，0～30 min為細胞初步粘附期，30～120 min為細胞面積快速增長期，120 min則進入緩慢鋪展期。

Akt 是PI3K 級聯反應中最經典的效應激酶之一，PI3K 誘導細胞膜磷脂酰肌醇的3'-OH 基團磷酸化，招募Akt到細胞膜上并介導其激活。有文獻報道FN可以激活卵巢癌細胞[16]、脊髓星形膠質細胞[17]和人腦膠質瘤細胞[18]中的PI3K-Akt通路，而本研究發現FN以時間依賴的方式介導Akt 磷酸化，這與之前的研究結果一致。值得注意的是，FN 介導的Akt 磷酸化在60 min 時達到峰值，而FN 介導的細胞鋪展在120 min 時到達平臺期，這表明Akt的磷酸化與細胞鋪展存在時間上的先后順序，Akt 的激活早于細胞鋪展；同時Akt 的激活在120 min時已經呈現下降的趨勢，而細胞的完全鋪展幾乎在120 min 時完成，這表明Akt 激活和細胞鋪展又存在時間上的相關性，提示FN介導內皮細胞鋪展的潛在分子機制可能與PI3K-Akt激活有關。眾所周知PI3KAkt 信號通路在調控內皮細胞遷移、增殖、存活以及凋亡中發揮重要作用[19-20]，而我們應用PI3K-Akt 抑制劑進行干預的實驗顯示：LY294002和渥曼青霉素都顯著抑制內皮細胞鋪展，這表明FN誘導的內皮細胞鋪展需要PI3K-Akt 信號的激活。盡管不同細胞的鋪展可能需要Syk[21]、局部黏著斑激酶[22]以及PI3K-Akt[23-24]等一系列細胞內信號的協同作用，但使用FN作為細胞粘附底物的研究證實，PI3K-Akt 信號通路對成纖維細胞[23]和GD25 細胞[24]的鋪展至關重要，這與本研究的結果一致。

整聯蛋白通常由一個α亞基和一個β亞基組成，表達于細胞膜表面，作為ECM的受體與細胞外的ECM結合，不僅增強了細胞與基質的結合強度，還可以激活多種細胞內信號傳導通路[25]。而對FN而言，其整聯蛋白受體通常為αvβ3和α5β1，FN通過RGD 序列與細胞上的整聯蛋白結合，因此細胞外給與RGDS 短肽可以抑制FN與其整聯蛋白受體的結合[10，26]。我們關于RGDS對Akt激活影響的實驗表明，使用RGDS短肽封閉整聯蛋白可顯著抑制FN誘導的Akt磷酸化，表明FN介導的PI3K-Akt信號通路激活依賴整合素。與我們的結果相一致，多篇文獻證實PI3K-Akt 是FN 與整聯蛋白結合后激活的信號轉導通路之一[27-28]。隨后，本研究進一步發現RGDS 顯著抑制了FN 誘導的HUVECs 鋪展，結合PI3K-Akt 抑制劑對細胞鋪展影響的實驗結果，表明FN通過整聯蛋白依賴的Akt激活介導內皮細胞鋪展。

4 結論

本研究探討了內皮細胞鋪展的潛在分子機制，發現整聯蛋白依賴的Akt激活對FN介導的內皮細胞鋪展至關重要。這一結果提示FN-整聯蛋白-PI3K-Akt 信號通路可能是臨床實踐中治療和預防血管新生疾病的潛在靶點。

（利益沖突：無）