hnRNPU基因敲減小鼠preB A70細胞株的構建及鑒定

張岱權，黃黎，金棕杰，唐詩琪，羅佳瑞，李林，趙雷，曹新梅

1.西南醫科大學附屬醫院中醫科（瀘州646000）；2.西南醫科大學基礎醫學院重大疾病的免疫機制及治療瀘州市重點實驗室（瀘州646000）；3.西南醫科大學基礎醫學院（瀘州 646000）

體液免疫的基礎是B 細胞受體（B cell receptor，BCR）的多樣性，BCR多樣性主要由BCR基因V（D）J重組形成，V（D）J重組發生于B細胞發育的早期階段，首先是proB 細胞的BCR 重鏈可變區基因發生V（D）J 重組，隨后preB 細胞發生BCR 輕鏈重組。V（D）J 重組是由重組激活基因（recombination activating gene，RAG）產物RAG1和RAG2介導的。通過重組，將基因組中原本分隔的V、D和J基因連接在一起。V、D和J基因都帶有一段保守的DNA 序列—重組信號序列（recombination signal sequences，RSSs）。RAG1/2 能夠識別RSSs 并且在此處切割DNA，形成一個發卡狀的編碼末端和一個信號末端[1]。斷裂的DNA由DNA依賴性蛋白激酶、Ar?temis、Ku70、Ku86、X 射線修復交叉互補蛋白5（X-ray repair cross-complementing protein 5，XRCC5）和XRCC4等非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）因子進行修復[2-3]。其中，編碼末端的發卡結構被打開，重新連接，形成編碼連接（coding joint，CJ）；信號末端直接連接形成環狀，即信號連接（signal joint，SJ），并從基因組中刪除[1]。

為了保證重組后形成有功能的BCR基因，同時防止破壞基因組DNA，V（D）J 基因重組有著嚴密的調控機制，如RAG表達的時空性[4]以及RAG1在細胞核的分布[5]，染色質可及性[6]，轉錄因子[如E2A[7]、成對盒5（paired box 5，Pax5）[8]等]，以及基因轉錄[9-10]在BCR基因V（D）J 重組中發揮重要的調控功能。此外，黏連蛋白介導的DNA環擠壓[11]也會影響VH-DHJH重組[12-13]。

不均一核糖核蛋白U（heterogeneous nuclear ribonu?cleoprotein U，hnRNPU），即核基質結合因子A（scaffold attachment factor A，SAFA），屬于不均一核糖核蛋白亞家族成員，是核基質的主要成分之一，其結構分為：N端的DNA 結合區、中間區和C 端的RNA 結合區[14-15]。hnRNPU 具有多種生物學功能，主要包括：調控染色質結構和基因轉錄[16]，參與RNA 代謝[17-18]，修復DNA 的氧化損傷[19]，調控有絲分裂[20]和細胞增殖[21]，調控mi?croRNA的胞外囊泡運輸[22]等。Ye等[17]的研究顯示，條件性敲除小鼠心臟中的hnRNPU基因，小鼠發生嚴重的擴張性心肌病，并在出生后2 周死亡。國外學者發現，hnRNPU突變的兒童表現為發育遲緩、智力障礙、癲癇及小腦癥等[23-24]。有趣的是，在小鼠模型中，淋巴細胞發育異常時，神經系統的發育也受到影響[25]。hnRNPU是否調控V（D）J重組及B細胞發育，尚未見相關報道。本研究旨在構建和鑒定hnRNPU-KD 的preB細胞株，從而為后續研究hnRNPU對早期B細胞V（D）J重組的調控作用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要材料與儀器

1.1.1 細胞株 A70 細胞（v-Abl 小鼠preB 細胞）用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（BasalMedia）、β-巰基乙醇、青霉素、鏈霉素的RPMI 1640 培養基（ATCC 改良型）（BasalMedia）培養。HEK293T 細胞用含10%FBS（BasalMedia）、青霉素、鏈霉素的DMEM 培養基（BasalMedia）培養。所有細胞均培養于37 ℃、5%CO2。

1.1.2 主要材料 pLKO.1-EBFP-PURO 質粒和感受態細胞DH5α購于中國擎科生物公司。Age I、EcoR I購于上海寶生物公司。T4 DNA ligase 購自美國NEB 公司。針對小鼠hnRNPU基因的shRNA序列（gaccggtCCGGCC TGGGAAATACAACATTCTTTTCAAGAGAAAGAATGT TGTATTTCCCAGGTTTTTGgaattcc）由擎科生物公司合成。rabbit anti-hnRNPU 購自abcam 公司，mouse anti-GAPDH 購 自proteintech 公司，goat anti-rabbit IgG 和goat anti-mouse IgG 購自Thermo 公司。包裝慢病毒的質粒pMDL、VSVG和pRSV-Rev，由本課題組保存。

1.1.3 主要儀器 PCR 儀、高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）、熒光倒置顯微鏡（德國萊卡公司）、凝膠成像儀（美國Biorad公司）。

1.2 方法

1.2.1hnRNPUshRNA 表達質粒的構建 利用Age I、EcoR I雙酶切pLKO.1-EBFP-PURO 質粒和靶向hnRNPU基因的shRNA 干擾序列。酶切的質粒經電泳檢測酶切成功后，回收純化。純化的質粒和插入片段，經T4 DNA ligase，室溫連接10 min。連接產物轉化感受態細胞，接菌，37 ℃培養過夜。挑取單克隆、搖菌，測序檢測。測序正確的單克隆（命名為pLKO.1-hnRNPUshRNA-EBFP-PURO）用于后續實驗。

1.2.2 表達hnRNPUshRNA的慢病毒的包裝HEK293T細胞接種于10 cm 培養皿。當細胞融合度達到70%左右，用聚醚酰亞胺（polyetherimide，PEI）進行轉染，其中質粒（μg）: PEI（μg）=1∶2，每一皿細胞轉染的質粒為pLKO.1-hnRNPUshRNA-EBFP-PURO 或者pLKO.1-EBFP-PURO（μg）∶pMDL（μg）∶pRSV-Rev（μg）∶VSVG（μg）=8∶4∶4∶4。轉染4～6 h后，棄去轉染試劑，補充含10%FBS 的DMEM 的完全培養基。細胞培養48 h后，收集含病毒的培養基，將其置于4 ℃，以500 g 離心4 min。吸出上清，用0.45 μm 的過濾器過濾后分裝，凍于-80 ℃。

1.2.3hnRNPU-KD 的A70 細胞株的構建 收集A70 細胞2管，每管1×106。取凍存的表達hnRNPUshRNA和空載的病毒上清各1 mL，在冰上融化后，加入polybrene至終濃度5 μg/mL，混勻。吸出病毒混懸液，分別加入到兩管A70 細胞，混勻，將其吸出至6 孔板。將其置于室溫，以1 800 rpm 離心90 min。隨后，細胞培養于37 ℃、5%CO2。第2 d換成完全培養基，繼續培養72 h。用倒置熒光顯微鏡觀察細胞是否有藍色熒光，判斷感染效果。將細胞培養基換成含2 μg/mL 嘌呤霉素的培養基，繼續培養7 d左右（每2 d換1次液），直至陰性細胞全部死亡。Western blot 檢測hnRNPU 表達的情況。將細胞進行有限稀釋，接種于96 孔板，每孔1 個細胞，用含2 μg/mL嘌呤霉素的培養基繼續培養，直至形成單細胞克隆。每個單細胞克隆取一部分進行Western blot檢測，其余的凍存于-80 ℃。hnRNPU-KD 的細胞克隆則繼續培養擴增，并用于后續實驗。

1.2.4 Western blot檢測hnRNPU蛋白的表達 用1×蛋白上樣緩沖液裂解細胞，100 ℃煮10 min。再將其置于4 ℃，以13 000 rpm 離心20 min。吸取上清，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sul?fate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。隨后轉PVDF膜，室溫快速封閉15 min，加入一抗（rabbit anti-hnRNPU、mouse anti-GAPDH）4 ℃孵育過夜。TBST 洗3 次后，加入二抗（goat anti-rabbit IgG、goat anti-mouse IgG）室溫孵育1 h。TBST洗3次。膜上滴加顯影液后，利用凝膠成像儀曝光。

2 結果

2.1 電泳檢測pLKO.1-EBFP-PURO質粒雙酶切產物

pLKO.1-EBFP-PURO 質粒經Age I、EcoR I雙酶切后電泳。結果顯示質粒已被切開，見圖1，可以用于后續實驗。

圖1 pLKO.1-EBFP-PURO質粒雙酶切產物的鑒定Figure 1 Identification of double digested production of pLKO.1-EBFPPURO

2.2 測序鑒定重構的pLKO.1-hnRNPU shRNAEBFP-PURO質粒

重構的pLKO.1-hnRNPUshRNA-EBFP-PURO 質粒轉化感受態細胞，涂板，培養過夜。挑取細菌單克隆測序。結果顯示目的片段已經插入到質粒中，見圖2，提示pLKO.1-hnRNPUshRNA-EBFP-PURO構建成功，可以用于包裝病毒。

圖2 pLKO.1-hnRNPU shRNA-EBFP-PURO質粒的測序結果Figure 2 The sequencing result of pLKO.1-hnRNPU shRNA-EBFPPURO

2.3 熒光顯微鏡檢測感染病毒的A70細胞

慢病毒感染A70 細胞72 h后，細胞內可以觀察到藍色熒光，見圖3，說明病毒已經成功感染細胞。

圖3 感染病毒的A70細胞的檢測（×400）Figure 3 Identification of A70 cells infected by viruses（×400）

2.4 hnRNPU蛋白的檢測

病毒感染A70 細胞72 h后，用嘌呤霉素篩選陽性細胞，提取總蛋白，利用Western blot檢測hnRNPU的表達。如圖4A、B所示，雖然各組間hnRNPU表達的差異性未達到統計學意義（P>0.05），但與對照組相比，實驗組的hnRNPU 減少了大約一半。將實驗組的細胞進行有限稀釋，培養成單細胞克隆，利用Western blot 檢測hnRNPU 的表達。結果顯示，細胞克隆1和克隆2的hnRNPU抑制率達到60%～70%，見圖5A、B，可以用于后續實驗。

圖4 hnRNPU蛋白表達的檢測Figure 4 Identification of hnRNPU expression

圖5 hnRNPU基因穩定敲低的細胞株的篩選Figure 5 Selection of stable hnRNPU-KD cell lines

3 討論

早期研究表明，在proB 細胞中，增強子Eμ可以引導DHJH基因群的轉錄[9]。Eμ引導的基因轉錄，可能對于DHJH區域染色質的開放至關重要[26]。OSIPOVICH等[10]發現，轉換/蔗糖不發酵復合物（switching/sucrose nonfermenting，SWI/SNF）是啟動整個Igh基因反義轉錄的基礎，當proB 細胞缺失SWI/SNF時，Igh基因不發生轉錄，VH、DH和JH基因片段也不能重組。以上研究均提示，V（D）J重組與基因轉錄息息相關。hnRNPU能夠結合actin和Pol II等，在轉錄的起始和延伸階段發揮調控作用[16，27]。因此，我們假設hnRNPU 可能調控V（D）J重組。

本研究成功構建了靶向小鼠hnRNPU基因的shRNA 的表達載體及慢病毒。但由于hnRNPU具有多種生物學功能[14，16，20，28]，對于細胞的生存至關重要[29]，在用嘌呤霉素篩選穩定細胞株時，我們沒有獲得hnRNPU-knockout 的單細胞克隆，只篩選到hnRNPUKD的克隆。

4 結論

本研究成功構建了hnRNPU基因穩定敲減的A70細胞株，為探討hnRNPU在V（D）J重組及早期B細胞發育中的調控奠定了實驗基礎。

（利益沖突：無）