新型衍生化纖維素和N-異丙基丙烯酰胺共修飾的多模式熱響應型手性固定相的制備

周靜秋，萬美君，何潔，代雪梅，羊洪林，王路軍

西南醫科大學藥學院藥物分析教研室（瀘州 646000）

高效液相色譜作為一種高效、快速、準確的分離分析方法，是分離純化化合物的常用工具[1-6]。而在分離親水性物質時，正相色譜采用的流動相對分析物的溶解性差，反相色譜則不能達到有效的分離[7]。1990 年Alpert 提出的親水相互作用色譜（hydrophilic interac?tion chromatography，HILIC），填補了這兩類色譜固定相在分離極性物質中的不足[8]。近年來，有大量文獻報道將多糖類[9-14]、弱陽離子交換[15-17]、親水碳納米材料[18-19]等功能基團作為配體鍵合到固定相表面，用于天然藥物、堿基核苷等親水性物質在HILIC 模式下的分離檢測。多糖類因具有很好的手性識別能力而同時在手性拆分方向得到了廣泛的研究和應用[20-25]。其中纖維素衍生物具有高度有序的螺旋結構和出色的手性識別能力，是最常用的手性固定相（chiral stationary phase，CSP）之一。在CSP 手性分離機理研究中，有三種或以上相互作用力存在于手性拆分過程之中，包括立體構象、疏水、氫鍵、包容絡合和范德華力等[26]。基于此理論，研究者通過在手性固定相上修飾不同基團來提高手性拆分能力[27-28]。N-異丙基丙烯酰胺（Nisopropylacrylamide，NIPAM）是一種分子結構中同時具有疏水性異丙基和親水性酰胺基的化合物，基于NIPAM的色譜固定相具有僅通過變化柱溫度就能達成分析物分離的優勢[29-34]。而結合NIPAM和纖維素的多模式固定相目前還未報道。故在本項研究中，以丙烯酸纖維素-（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（NCAD）和NIPAM 為功能單體，通過自由基引發共聚反應（atom transfer radical polymerization，ATRP）接枝到硅膠上，制備了具有多種分離機制和對映體分離能力的色譜固定相（Sil-NP-NCAD）。

1 材料與實驗方法

1.1 儀器與材料

IR Affinity?1（島津，日本）對衍生化的纖維素和硅球上接枝的功能團進行表征，CHN628 系統（LECO，美國）對硅球及接枝在硅球表面的功能團進行表征，HYHPLC-S（Hydrosys，德國）將制備的高效液相色譜固定相填料裝填入色譜柱，用于裝填固定相填料的不銹鋼柱（15 cm×4.6 mm）購自中國大連日普利科技儀器有限公司，最后高效液相實驗在安捷倫1260型高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器（安捷倫，美國）上進行。

球形硅膠（直徑5.50 μm，孔徑100 μm，比表面積465 m2·g-1）購買于日本Daiso Chemicals 公司，4-（氯甲基）苯基三甲氧基硅烷購于美國Gelest公司，N-甲基咪唑、氯丙烯、丙烯酰氯、3，5-二甲基苯基異氰酸酯、N-異丙基丙烯酰胺、氯化銅購于中國阿達馬斯試劑有限公司，氯化亞銅、三（2-二甲氨基乙基）胺（tris（2-（di?methylamino）ethyl）amine，Me 6 TREN）購于中國阿拉丁化學有限公司，硫脲、尿苷、腺苷、腺嘌呤、胞嘧啶、二苯胺、間苯二胺、1，4-苯二胺和華法林等標準測試品購于中國阿達馬斯試劑有限公司，納米纖維素（nanocellulose，NC，直徑50 nm）購于中國麥克林試劑有限公司，用于調節流動相pH的氨水和甲酸購自中國成都凱隆試劑公司，超純水由美國艾科浦AWL-1002-H 超純水系統純化后獲得，色譜級乙腈購于中國阿達馬斯試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 纖維素3，5－二甲基苯基氨基甲酸酯（NCAD）的制備 參照文獻的方法合成了1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽（AmimCl）作為纖維素在反應中的溶劑[35]。如圖1A 所示，將0.25 g 納米纖維素加入6 g AmimCl中，在80°C 下機械攪拌1.5 h，得到4 wt%的纖維素溶液。然后將0.062 mL丙烯酰氯加入混合物中，在50°C下反應1.5 h。然后，將2.07 mL 3，5-異氰酸二甲酯與液體混合，在80°C下保持反應24 h。所得產物用400 mL甲醇重結晶，后用200 mL 二甲基亞砜和200 mL甲醇洗滌得到的固體以除去未反應的丙烯酰氯和3，5-異氰酸二甲酯，得到的NCAD在60°C的真空干燥箱中干燥過夜。

1.2.2 引發劑改性硅球（Sil-Cl）的制備 5.0 g硅球分散在150 mL 1 mol/L 的鹽酸溶液之中，在90oC 回流攪拌3 h 后使用2 L 純水洗滌至中性，然后將活化后的硅球在150oC 真空干燥箱中干燥24 h。接著如圖1B 所示，將2.5 g活化硅膠和0.68 mL 4-（氯甲基）苯基三甲氧基硅烷加入50 mL 無水甲苯中，室溫下攪拌反應16 h，然后用200 mL甲醇、200 mL二氯甲烷和200 mL丙酮清洗過濾后的沉淀。最后將Sil-Cl在55oC的真空干燥箱中干燥過夜。

1.2.3 Sil-NP-NCAD 的制備 采用ATRP反應聚合硅球表面的功能單體。如圖1C所示，2.79 g NIPAM、1.89 g NCAD與50 mL異丙醇溶解于三頸瓶中，將0.213 g氯化亞銅、0.029 g氯化銅和0.517 g Me6TREN的催化劑體系快速加入無氧環境下的三頸瓶中，然后將混合溶液攪拌反應30 min。再加入2.5 g Sil-Cl，在室溫氮氣保護下進行反應16 min后得到接枝了NIPAM與NCAD的硅球，將其用200 mL甲醇、200 mL乙二胺四乙酸（EDTA）溶液、200 mL 水、200 mL DMSO 和300 mL 丙酮連續沖洗，最后在55oC 下的真空干燥箱中干燥過夜得到Sil-NP-NCAD。

圖1 Sil-NP-NCAD色譜固定相的制備過程Figure 1 Scheme for the systhesis of Sil-NP-NCAD stationary phase

1.2.4 色譜柱的裝填與活化 采用漿液充填法制備4.6 mm×150 mm的混合模式高效液相色譜柱，以10 mL異丙醇和乙腈（1∶1，v/v）的混合溶液為溶劑，加入2 g Sil-NP-NCAD 固體材料，將其充分混合攪拌，再超聲震蕩3 min，得到無色透明的勻漿液；甲醇作為頂替液，將壓力緩慢上升至50 MPa 保持20 min，然后減壓至30 MPa保持10 min，緩慢降壓至零，靜止3 至5 min，卸下柱子后用刀鏟平柱頭。以甲醇為流動相，持續沖洗色譜柱5 h以上，從而活化色譜柱。

2 結果

2.1 Sil-NP-NCAD固定相填料的表征

2.1.1 元素分析 采用元素分析對功能基團鍵合至硅球表面的情況進行表征。如表1 所示，相對于裸硅球而言，Sil-Cl 的碳含量升至1.93%，根據公式可計算出Sil-Cl 上碳元素的鍵合密度為2.67 μmol·m-2，表明4-（氯甲基）苯基三甲氧基硅烷成功接枝到二氧化硅表面。Sil-NP-NCAD材料的氮含量增加至0.3%，碳含量升至6.17%。通過公式，可計算出Sil-NP-NCAD 材料上的氮元素和碳元素的鍵合密度分別增加至3.85 μmol·m-2和9.48μmol·m-2，表明纖維素酯和NIPAM 已成功接枝到硅球表面。為評價功能基團鍵合率，鍵合密度的計算公式如下：

表1 SiO2、Sil-MPS與Sil-NP-NCAD的元素分析Table 1 Element analysis results of SiO2，Sil-MPS and Sil-NP-NCAD

鍵合密度（μmol·m-2）=（Z%×106）/（MZ×S）

式中：Z 代表被計算的相應元素，Z%為相應元素百分含量；MZ為相應元素的相對原子質量；S為裸硅膠的表面積（465 m2·g-1）。

2.1.2 紅外光譜分析 用紅外光譜法驗證了纖維素衍生化合物和嫁接不同功能單體的二氧化硅的合成成功。如圖2A 所示，與NC 的紅外吸收光譜相比，NCAD的吸收峰明顯不同，3 293 cm-1處的吸收峰是N-H的拉伸振動峰，1637 cm-1和1 562 cm-1處的吸收峰分別為C=O和C=C的拉伸振動峰。以上結果證實了丙烯酰氯和3，5-二甲基異氰酸苯酯已經成功地與纖維素結合。裸硅球、Sil-Cl、Sil-NP-NCAD 的紅外譜圖如圖2B所示，裸硅球在968 cm-1處的吸收峰是Si-OH的伸縮振動峰。而Sil-Cl 的譜圖中968 cm-1處的峰強度明顯下降，證明4-（氯甲基）苯基三甲氧基硅烷已成功被接枝到硅球表面。Sil-NP-NCAD的譜圖中，3 295 cm-1處的是N-H 的伸縮振動峰，1 651 cm-1處的吸收峰為C=O的伸縮振動峰，1 560 cm-1、1 495 cm-1和1457 cm-1出現了苯環的特征峰。以上結果證明了固定相的成功制備。

圖2 紅外表征圖譜Figure 2 FT-IR spectrums

2.2 Sil-NP-NCAD固定相上的色譜行為

本實驗通過對硫脲（脂水分配系數lg P=-0.39）、尿苷（lg P=-1.61）、腺苷（lg P=-1.02）、腺嘌呤（lg P=-2.12）和胞嘧啶（lg P=-2.29）五種核苷類標準品進行分析來評價Sil-NP-NCAD 在親水相互作用模式下的分離性能。如圖3A 所示，在以乙腈/甲酸銨緩沖鹽（93:7，v/v）為流動相和流速為1 mL/min 的條件下，五種核苷類標準品的混合物在Sil-NP-NCAD 上實現了良好的分離，且相鄰色譜峰的分離度均已大于1.5。為進一步驗證其保留機理，通過改變流動相中水相的百分比來觀察核苷類分析物在固定相上的保留時間的變化規律，此過程中流動相組成中有機相為乙腈，水相為20 mmol/L 甲酸銨水溶液（pH=5.88）。如圖3B 所示，隨著流動相中水相比例的降低，核苷類物質在固定相上的保留時間逐步縮短。接下來，如圖3C所示，在10°C～50°C的溫度范圍內對制備的色譜柱的熱響應洗脫能力進行考察，隨著柱溫度的降低，制備的柱對分析物的保留增強。

圖3 核苷類在Sil-NP-NCAD 柱上的色譜分離圖Figure 3 Chromatographic separations of nucleoside and nucleic bases on Sil-NP-NCAD column

接著采用苯胺類物質包括二苯胺（lg P=2.97）、聯苯二胺（lg P=1.56）、間苯二胺（lg P=-0.31）、1，4-苯二胺（lg P=-0.68）對制備的Sil-NP-NCAD固定相溫度響應分離能力進行進一步考察。如圖4A所示，在乙腈/水（80∶20，v/v）和流速為1 mL/min的條件下，二苯胺、間苯二胺和1，4-苯二胺在該色譜固定相上達到完全分離，接著在相同流動相條件下改變流速至0.8 mL/min，二苯胺、聯苯二胺、間苯二胺和1，4-苯二胺分離情況如圖4B 所示。聯苯二胺和前后兩種分析物的色譜分離度均未達1.5，故選取二苯胺、聯苯二胺和間苯二胺在10°C-50°C 的溫度范圍內對制備柱的熱響應性洗脫能力進行進一步考察。如圖4C 所示，隨著柱溫降低，三種分析物的保留時間逐漸延長，在10°C成功實現了三種苯胺的分離。

圖4 苯胺類在Sil-NP-NCAD 柱上的色譜分離圖Figure 4 Chromatographic separations of anilines on Sil-NP-NCAD column

對手性化合物分離過程中，如圖5A 所示，Sil-NPNCAD 固定相成功實現了對手性藥物華法林Warfarin（lg P=3.42）的對映體拆分；圖5B所示，接著在10°C-50°C 的溫度范圍對華法林在固定相上的色譜行為進行考察，華法林對映體分離隨柱溫度的變化不明顯。

圖5 華法林在Sil-NP-NCAD 柱上的色譜分離圖Figure 5 Chromatographic separations of warfarin on Sil-NP-NCAD column

3 討論

NCAD 作為一種具有良好手性識別能力的功能單體，NIPAM 作為一種疏水和親水結構共存且可在溫度調節下改變其疏水性的熱響應材料，其在32°C的低臨界溶解溫度（lower critical solution temperature，LCST）左右，疏水和親水性可以切換。在低溫下，NIPAM聚合物膨脹，NIPAM高分子鏈中的酰胺基暴露出來，易與周圍的水分子產生分子間氫鍵作用。而在高溫下，NIPAM高分子鏈會收縮并形成分子內氫鍵，使得疏水作用逐漸加強[36]。將兩者通過ATRP 反應修飾到硅球上，開發了一種具有親水分離機制、溫度響應機制和對映體分離能力的多模式色譜固定相，并為親水性、手性化合物開辟了一種新型色譜分離方法。

本研究采用元素分析對接枝量不同化合物的硅球產物（二氧化硅、Sil-Cl和Sil-NP-NCAD）上的接枝量進行了計算；采用紅外光譜儀對硅球產物進行了表征，根據紅外光譜上的特征峰的位置確定了硅球上存在的功能基團。這些表征結果為Sil-NP-NCAD 固定相的色譜保留機制研究提供了論據。

為驗證該制備色譜固定相是否具有多重作用模式，采用親水性核苷類、苯胺類物質的混合物來考察其親水相互作用模式。本項研究通過改變流動相的水相比例驗證了其親水相互作用模式，然后通過考察分析物的保留時間與色譜柱溫度變化的關系，進一步證明了該制備色譜柱具有的溫度響應模式。大部分核苷類物質出峰順序都與物質本身的lg P 值大小相關，腺苷相較尿苷的保留時間更長，說明除了親水相互作用力以外，具有伯氨基的腺苷還與固定相產生了氫鍵相互作用，從而延長了保留時間。接著，如圖3B所示，隨著流動相中水相比例的降低，核苷類物質在固定相上的保留時間逐步縮短。這是一種典型的親水模式作用下的保留特征。這進一步證明了該固定相材料可以與核苷類產生親水相互作用，具有在親水模式下分離核苷類的保留機制。接下來，如圖3C 所示，隨著柱溫度的降低，制備的柱對分析物的保留增強。其原因是固定相表面的共聚物鏈在低溫下膨脹并展現出親水性，和核苷類分析物發生親水相互作用。因此本實驗制備的Sil-NP-NCAD固定相在親水模式下對核苷類化合物具有一定的熱響應能力。

關于苯胺類的分離情況如圖4B所示，四種苯胺類出峰順序按其lg P 值由大到小先后出峰，這證實了該色譜固定相能與苯胺類產生親水相互作用。如圖4C所示，二苯胺、聯苯二胺和間苯二胺在10°C實現分離。這是由于在低溫下固定相上的共聚物鏈親水基團暴露，與分析物產生了分子間氫鍵作用，從而延長了分析物的保留時間。因此本實驗制備的Sil-NP-NCAD 固定相在親水模式下對苯胺類化合物進行分離，且能通過對溫度變量的控制對固定相的親水性做出調節，使原本不能分離的化合物實現分離。

此外，華法林的對映體分離情況沒有明顯隨柱溫度的變化而變化（圖5B）。畢竟相對疏水的華法林與核苷類的在色譜柱上的熱響應是不同的。根據HPLC 上的速率理論，流動相粘度隨溫度的增加而降低。隨著柱溫度的升高，分析物的保留時間會降低[37]。但華法林在Sil-NP-NCAD 柱上的保留時間隨溫度的升高幾乎保持不變。這些結果表明，制備的手性固定相通過提高溫度從親水性轉變為疏水性，能與具有疏水基團的化合物發生更強的疏水相互作用。這結果也證明了Sil-NP-NCAD固定相具有一定的熱響應調節能力。

以上實驗結果驗證了基于衍生化纖維素與NIPAM的多模式溫度響應手性固定相的成功制備。Sil-NPNCAD 固定相的制備是對普通單模式HILIC 色譜柱的補充，也為新型多模式色譜柱的開發提供可靠的依據。

4 結論

本研究采用ATRP 反應制備得到衍生化纖維素和N-異丙基丙烯酰胺共聚物功能化的多模式熱響應型手性固定相，并對其色譜行為進行了分析與評價。該固定相實現了對核苷和苯胺類親水物質的分離，也成功對華法林對映體進行了拆分，在生物樣品中核苷類親水性物質的分離分析中具有廣闊的應用前景。同時該固定相能在一定的溫度范圍對其親水性與疏水性進行調節，具有實現對復雜樣品進行分離的潛力。

（利益沖突：無）