無創篩查非酒精性脂肪性肝病相關肝纖維化新血清標志物

趙曉彤，曹武奎(通信作者)

天津市第二人民醫院檢驗科 (天津 300192)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳乙肝密切相關的代謝應激性肝損傷。疾病譜包括非酒精性單純性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。NAFLD不僅可導致肝病患者殘疾和病死，還與代謝綜合征、2型糖尿病、動脈粥樣硬化性心血管疾病及結直腸腫瘤等高發疾病密切相關。目前，NAFLD已成為我國第一大慢性肝病和健康查體肝酶異常的首要原因，且越來越多的慢性乙型肝炎病毒感染患者合并NAFLD，嚴重危害患者的生命健康。同時，NAFLD也正成為世界肝病的主要病因。據統計，NAFLD的全球流行率約為25%[1]。亞洲國家的NAFLD患病率約為27.4%[2]。據報道，肥胖(51.34%)、高脂血癥(69.16%)、高血壓(39.34%)和代謝綜合征(42.54%)的人群患有NAFLD的概率更高[3-5]。

NAFLD的典型臨床進展路徑是：NAFLD—NASH—纖維化—肝硬化—肝功能衰竭—HCC。臨床發現高達50%的HCC病例可能發生在沒有肝硬化的情況下[6-7]。15%～20%的NAFLD患者可進展為NASH，30%～40%的NASH患者可發展為纖維化，其中15%～20%的NASH患者可進一步進展為晚期纖維化(F3/F4期肝纖維化)或肝硬化(F4期肝纖維化)[8]。然而，NAFLD患者在沒有NASH的情況下也可能會發展為纖維化[9]。NAFLD與肝臟相關病死率、肝癌和總病死率的增加有關[5,10]。嚴重肝病的風險比隨著纖維化分期的增加而增加，而NASH不存在纖維化風險[11]。纖維化階段是NAFLD疾病特異度病死率的最強預測因子[12]。沒有其他組織學特征的纖維化階段可預測NAFLD的全因病死率和疾病特異度病死率[13]。晚期纖維化是導致NAFLD患者病死的獨立預測因子[14]。NAFLD病死率隨著纖維化分期的增加呈指數增加[15]。

因此，早期發現NAFLD患者纖維化對于控制與這種高度流行疾病相關的病死率至關重要。現對NAFLD的非侵入性血液生物標記物的最新進展進行綜述，以輔助臨床診斷。

1 單項生物標志物的研究進展

肝纖維化是一種由各種原因(肝炎、毒素、游離脂肪酸等)引起的自然傷口愈合反應，可引起炎癥和肝細胞損傷。肝纖維化主要的細胞過程包括激活肝星狀細胞，肌成纖維細胞和細胞外基質的形成，肝細胞的減少，細胞外基質和纖維膠原的積累。參與這些過程的分子可作為生物標志物，包括蛋白質、微小核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)和長非編碼RNA。參與調節纖維化形成的生物標志物在輔助診斷肝纖維化中的應用效果優于僅僅是纖維化最終結果的指示物(如膠原蛋白等)。

1.1 多花紫藤凝集素陽性mac-2結合蛋白(wisteria floribunda lectin mac-2-binding protein，WFA+-M2BP)與Ⅳ型膠原氨基末端肽(7S)

Ogawa等[16]檢測了WFA+-M2BP和Ⅳ型膠原7S在165例NAFLD患者中的表達情況，經肝活檢發現呈顯著纖維化表現；以0.83 ng/ml為臨界值時，血清WFA+M2BP診斷纖維化階段≥2期的曲線下面積為0.832(95%可信區間為0.771～0.894)；以5.2 ng/ml為臨界值時，血清Ⅳ型膠原7S診斷纖維化階段≥2期的曲線下面積為0.837(95%可信區間為0.778～0.898)；使用上述截斷值，WFA+-M2BP確診了73.2%的顯著纖維化患者，Ⅳ型膠原7S確診了80.5%的顯著纖維化患者，其中62.2%的患者WFA+-M2BP和Ⅳ型膠原7S均超過閾值。

WFA+-M2BP是紫藤凝集素陽性Mac-2結合蛋白，又被命名為M2BPGi，即Mac2結合蛋白糖基化異構體。Mac-2結合蛋白的官方基因名稱是半乳凝素3結合蛋白(galectin 3 binding protein，LGALS3BP)(www.genecards.org)。糖蛋白可能是肝纖維化的潛在生物標志物，是否可將更多的糖蛋白作為纖維化的生物標志物有待進一步發現并證實。

1.2 幾丁質酶3樣蛋白1(chitinase-3-like-1 protein，CHI3L1)和Ⅳ型膠原7S

CHI3L1是一種含383個氨基酸，分子量為42.6KD的單體糖基化蛋白，為糖基水解酶家族成員之一，其可結合殼多糖，但無殼多糖酶的活性，在炎癥和組織重塑中起著重要作用。CHI3L1最初被認定為乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒患者纖維化的生物標志物[17-21]。Kumagai等[22]發現，NAFLD患者血清CHI3L1水平會隨著肝纖維化程度的加重而升高。

CHI3L1的優勢在于其與NAFLD患者的脂肪變性、炎癥、細胞膨脹等均無相關性。當與Ⅳ型膠原7S結合使用算法[-0.0545+Ⅳ型膠原7S×0.3456+CHI3L1×0.0024]，截斷值為2.06時，曲線下面積增加到0.8763[22]。CHI3L1被包括在NIS4算法中使用α-2-巨球蛋白、微小基因(microgene，MIR)34a、CHI3L1和糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)來識別需要治療的NAFLD患者[23]。此外，HbA1c與NAFLD患者的纖維化進程有關[23]。當HbA1c水平≥8.0%時，NAFLD患者的肝纖維化概率會增加，當HbA1c水平≥6.5%時，則與潛在的肝纖維化顯著相關[24]。

1.3 血清細胞角蛋白18片段(cytokeratin18，CK18-F)

CK18-F可作為NAFLD的非侵入性生物標志物[25]。血清CK18-F水平與脂肪變性、炎癥、細胞膨脹以及整體NAFLD活動評分密切相關。以230 U/L為臨界值時，CK18-F預測NAFLD的曲線下面積為0.762、靈敏度為0.89、特異度為0.65；以270 U/L為臨界值時，CK18-F預測NASH的曲線下面積為0.757、靈敏度為0.64、特異度為0.76。對于NAFLD相關性肝纖維化的分期，CK18-F僅在F0和F1之間差異有統計學意義(P=0.0102)，而在F1、F2、F3和F4之間差異無統計學意義[25]。

1.4 金屬蛋白酶組織抑制因子-1

Yilmaz和Eren[26]的研究發現，有明顯纖維化的NAFLD患者僅金屬蛋白酶組織抑制因子-1水平顯著高于無纖維化的NAFLD患者(P=0.03)。

1.5 胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和胰島素樣生長因子結合蛋白5(Insulin like growth factor binding protein 5，IGFBP5)

Colak等[27]發現，中、重度纖維化患者血清IGF-1濃度明顯低于無纖維化或輕度纖維化的患者(P=0.001)；以63.6 mg/L為臨界值，曲線下面積為0.85、靈敏度為75%、特異度為91%；此外，中、重度纖維化患者的血清IGFBP5水平明顯高于無纖維化或輕度纖維化的患者(P=0.028)；以630.1 mg/L為臨界值，曲線下面積為0.74、靈敏度為75%、特異度為80%。

1.6 Ⅲ型前膠原氨基端肽(type Ⅲ procollagen amino peptide，PⅢNP)

PⅢNP是鑒別不同程度NASH的良好標記物[28]。然而，PⅢNP作為區分不同程度纖維化的標記物并不理想，區分F0與F1～2的曲線下面積為0.63，區分F0～1與F2的曲線下面積為0.65。

1.7 白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)

血清IL-8、骨橋蛋白和單核細胞趨化蛋白1與NAFLD患者的肝纖維化相關。在控制了年齡、性別、體質量指數、糖尿病、高血壓和代謝綜合征狀態后，發現IL-8與肝纖維化程度呈顯著相關性(P=0.001)[29]。

1.8 循環長鏈非編碼RNA lnc18q22.2

Atanasovska等[30]對來自NASH(48例)、單純脂肪變性但無NASH(11例)和健康對照(23名)的82例肝活檢標本進行了4 383個長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)的基因表達譜分析，發現了1個肝臟特異的lncRNA(lnc18q22.2，RP11-484N16.1)，其與NASH分級(r=0.51，P=8.11×10-7)、小葉性炎癥(r=0.49，P=2.35×10-6)以及非酒精性脂肪性肝病活動性評分(r=0.48，P=4.69×10-6)相關。然而，是否能在血液中檢測到這種lncRNA以及將其作為NALFD肝纖維化生物標志物的性能還有待進一步研究。

1.9 過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)的血漿脫氧核糖核酸(deoxyriboNucleic acid，DNA)甲基化

當PPARγ基因啟動子甲基化閾值為81%時，可將26例經活檢證實的NAFLD患者分成輕、重度兩組，其曲線下面積為0.91，靈敏度和特異度分別為0.83和0.93[31]。

2 巨噬細胞相關標志物

肝巨噬細胞通過與肝星狀細胞和其他免疫細胞相互作用，在炎癥和纖維化的調節中發揮重要的作用。因此，通過關注巨噬細胞相關因子來探索可行的肝纖維化生物標志物是合理的。巨噬細胞相關因子主要包含白細胞介素-34、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素7(Sialic acid binding immunoglobulin like lectin 7，sSiglec7)和可溶性CD163分子(Soluble CD163 molecule，sCD163)。在NAFLD患者的肝臟中，白細胞介素-34由活化的成纖維細胞產生，sSiglec7由巨噬細胞分泌，sCD163是白細胞介素-6誘導的清除結合珠蛋白-血紅蛋白復合物的巨噬細胞受體，在巨噬細胞上表達，并在巨噬細胞激活后上調。Soshio和Kanto[32]發現，血清白細胞介素-34、CHI3L1和sSiglec7水平與肝纖維化密切相關，可作為NAFLD/NASH的診斷生物標志物。另外，在慢性乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染和NAFLD患者中，sCD163水平與纖維化分期相關。在NAFLD患者中，sCD163在肝臟的表達與脂肪變性的程度相關。這些標記物檢測晚期肝纖維化的靈敏度和特異度各不相同，能分別對NAFLD患者的晚期纖維化，輕、中度纖維化，HCC提供診斷依據。建議將這些標記物與其他方式相結合以輔助診斷。

3 其他相關標志物

目前，NAFLD患者纖維化分期的評估方案是使用生物標記物將患者大致分為無、中度(F0～2)或重度(F3～4)纖維化。從更廣泛的公共衛生角度來看，這可能足以識別和分層患者，以便更好地對NAFLD患者進行臨床管理或治療。另一方面，在來自患者的活檢樣本中，僅因采樣錯誤，導致纖維化診斷錯誤超過一個分期的發生率高達33.1%[33]。然而，期望生物標記物的表現遠遠高于活檢本身的準確度是不現實的，活檢本身的準確度為70%～80%，這取決于醫院設備或病理學家的技術水平。現在亟需創新一種方法以取代活檢作為金標準，并提出新的指標來評估纖維化生物標記物，或者建立全新的標準，如測量纖維化進展的速度和方向，而非強制進行靜態的纖維化分期。比較折中的辦法是限制(或集中)生物標記物的應用范圍，以此作為輔助判斷依據，以最大限度地減少活檢次數。在這種情況下，具有高陽性預測值或高陰性預測值的生物標志物檢測可幫助識別不需要活檢的患者。此外，循序漸進的算法似乎比同時使用所有生物標志物作為綜合得分的算法的效果更好[34-35]。蛋白質組學和系統生物學等新技術可能會為評估纖維化分期或進展速度提供進一步的創新[36]。

4 小結

廣泛的基礎和臨床研究已經為肝臟炎癥、纖維化進展和癌變的機制提供了有用的信息。NAFLD是一個日益增長的全球公共衛生問題，需要公共衛生診斷、系統科學、營養、肝病和臨床腫瘤學領域的學者進行長期研究。目前，針對NAFLD纖維化的標志物眾多，包括WFA+-M2BP、CHI3L1、CK18-F、IGF-1等單項生物標志物，以及白細胞介素-34、sSiglec7、sCD163等巨噬細胞相關標志物等。根據無創篩查肝纖維化相關的標志物，可對NAFLD進行早期評估，對控制NAFLD患者的病死率具有重要的臨床意義。