腸道干細(xì)胞衰老機(jī)制研究進(jìn)展及針灸應(yīng)用思考?

陳雅男，翁志軍，趙 琛，鄭寒丹，劉雅楠，李昆珊，陸 嫄，馬 喆，崔云華，△

1上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所

腸道干細(xì)胞（intestinal stem cells，ISCs）是成體干細(xì)胞定向分化出的一種具備終生自我更新與分化特性的細(xì)胞，位于Lieberkunn’s隱窩中。ISCs分化出的定向祖細(xì)胞分為五種：吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、M細(xì)胞、潘氏細(xì)胞。前四種都會(huì)向腸腔方向遷延，總稱為腸道上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IECs），因ISCs與IECs的生理關(guān)系比較緊密，所以經(jīng)常將這兩類細(xì)胞一同分析描述。現(xiàn)就近年腸道干細(xì)胞衰老機(jī)制研究進(jìn)展及相關(guān)針灸研究進(jìn)行綜述。

1 影響腸道干細(xì)胞衰老的因素

腸道干細(xì)胞作為成體干細(xì)胞定向分化出的一種，具有自我更新并特化成為某種組織類型的細(xì)胞功能［1］。它在特定條件下，或者產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或者按一定的程序分化，從而使器官和組織的細(xì)胞保持生長(zhǎng)和衰退的動(dòng)態(tài)平衡。

近年來(lái)，關(guān)于干細(xì)胞衰老的學(xué)說(shuō)相繼被提出，其中具有代表性的有程序性衰老理論、自由基衰老學(xué)說(shuō)、端粒損傷理論、DNA損傷學(xué)說(shuō)、線粒體損傷學(xué)說(shuō)、表觀遺傳修飾學(xué)說(shuō)及熱量限制學(xué)說(shuō)（caloric restriction，CR）。有學(xué)者［2］認(rèn)為，生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)分子構(gòu)成了一種供干細(xì)胞增殖與分化的微環(huán)境，同時(shí)分泌各種各樣的細(xì)胞因子，其產(chǎn)物是隨干細(xì)胞的衰老而變化的。表明微環(huán)境的衰老標(biāo)志著系統(tǒng)環(huán)境的改變，干細(xì)胞的微環(huán)境在維持干細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)衰老方面起著重要作用［3］。所以整個(gè)腸道的衰老變化對(duì)于研究腸道干細(xì)胞的衰老機(jī)制具有重要意義。研究［4］顯示，相對(duì)于年輕小鼠，衰老小鼠的小腸衰老表現(xiàn)在隱窩數(shù)量均勻減少，腸絨毛增大且數(shù)量減少，同時(shí)絨毛微血管結(jié)構(gòu)也有改變。研究［5］發(fā)現(xiàn)，潘氏細(xì)胞的數(shù)量和分泌功能在成年之后隨著年齡顯著下降。

1.1 線粒體DNA損傷以及副產(chǎn)物對(duì)腸道干細(xì)胞的影響線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）具有調(diào)控細(xì)胞合成與凋亡［6］的作用。有學(xué)者認(rèn)為，mtDNA由于被損傷及復(fù)制過(guò)程產(chǎn)生大量突變，導(dǎo)致氧化磷酸化能力下降，體內(nèi)供能不足隨之發(fā)生衰老。哺乳動(dòng)物的mtDNA通過(guò)氧化磷酸化反應(yīng)（oxidative phosphorylation，OXPHOS）過(guò)程產(chǎn)能的同時(shí)會(huì)有副產(chǎn)物，其中一種就是自由基（reactive oxygen species，ROS），它是損害干細(xì)胞DNA完整性和穩(wěn)定性的重要因素之一。大量研究［7-8］證實(shí)它參與了多種疾病的發(fā)生，且其與腫瘤和衰老的關(guān)系尤為密切。人體接觸紫外線和X射線及一些有毒化學(xué)物和某些食物都會(huì)生成ROS，這些誘因還可導(dǎo)致mtDNA等線粒體基因發(fā)生突變，抑制氧化磷酸化反應(yīng)導(dǎo)致ROS增加，進(jìn)而損害線粒體功能，促使細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞死亡累積到一定程度時(shí)，器官功能衰退就會(huì)出現(xiàn)衰老表征［9］。ROS與其他新陳代謝所產(chǎn)生的有害產(chǎn)物都可被超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）清除，同時(shí)SOD還可抗阻ROS對(duì)細(xì)胞的傷害并及時(shí)進(jìn)行修復(fù)［10］。反之，衰老機(jī)體中SOD清除自由基的能力減弱，也可間接促使細(xì)胞衰老［11］。

除了ROS的刺激因素，基因組在復(fù)制過(guò)程中往往會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，為了糾正這些錯(cuò)誤，人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生與DNA損害相適應(yīng)的細(xì)胞應(yīng)答以修復(fù)細(xì)胞、減緩老化進(jìn)程［12］。另外還有研究［13］發(fā)現(xiàn)，小鼠干細(xì)胞自噬異常可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)丟失，增加線粒體的損傷與氧化壓力，使年輕的細(xì)胞加速衰老。

線粒體呼吸鏈（respiratory chain，RC）在線粒體DNA產(chǎn)生ATP的過(guò)程中扮演了重要的角色。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在衰老的人體組織內(nèi)，RC缺陷的干細(xì)胞增殖能力降低并增加后代的細(xì)胞凋亡率，導(dǎo)致腸隱窩細(xì)胞群減少。老年人的小腸干細(xì)胞的子代細(xì)胞由于呼吸鏈的缺陷導(dǎo)致增殖減少，凋亡增加［14-15］。

1.2 腸道干細(xì)胞衰老過(guò)程中端粒、端粒酶的研究觀察端粒（tolemere）是真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，端粒隨著年齡增長(zhǎng)縮短，這是一種經(jīng)典的衰老機(jī)制。具有活性的端粒酶的存在意義就是延緩端粒長(zhǎng)度的縮短速度。研究［16］發(fā)現(xiàn)，12個(gè)月的端粒酶基因敲除小鼠出現(xiàn)早衰現(xiàn)象，比如腸壁絨毛萎縮，甚至某些區(qū)域絨毛和黏膜扁平縮短。Klotho與端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度有關(guān)，可直接影響干細(xì)胞的衰老過(guò)程，并且認(rèn)為干細(xì)胞功能障礙是由Klotho缺陷和端粒縮短引起的。

1.3 腸道干細(xì)胞衰老和表觀遺傳學(xué)說(shuō)二者的關(guān)系表觀遺傳和干細(xì)胞衰老是機(jī)體衰老的兩個(gè)重要因素。表觀遺傳會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和狀態(tài)進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老和壽命，影響基因表達(dá)。在衰老過(guò)程中，表觀遺傳的改變可導(dǎo)致干細(xì)胞損耗［17-18］。而干細(xì)胞損耗是導(dǎo)致多種組織發(fā)生衰老相關(guān)的生理病理學(xué)變化的重要原因。因此，表觀遺傳擁有控制干細(xì)胞建立以及維持的功能，所以干細(xì)胞的表觀遺傳失調(diào)可導(dǎo)致發(fā)生衰老和衰老相關(guān)疾病［19］。

1.4 相關(guān)信號(hào)通路對(duì)腸道干細(xì)胞衰老的影響“早熟性衰老”是干細(xì)胞衰老的一種形式，是指以外界刺激導(dǎo)致干細(xì)胞微環(huán)境的變化，阻滯干細(xì)胞增殖而衰老。這種形式與一些信號(hào)通路有密切聯(lián)系，其中Wnt信號(hào)通路在衰老的過(guò)程中有重要的調(diào)控作用［20］。研究證實(shí)，腸上皮細(xì)胞增殖的主要?jiǎng)恿?lái)源為Wnt通路，衰老時(shí)ISCs中Wnt信號(hào)傳導(dǎo)下降［21］，證實(shí)了該因素在衰老進(jìn)程中的重要性［22］。另有研究表明，ISCs中主要減少的經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致機(jī)體衰老過(guò)程中ISCs功能衰退及Paneth細(xì)胞和間充質(zhì)中Wnt3表達(dá)下調(diào)，可能促進(jìn)衰老腸道干細(xì)胞中經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)活性的降低，繼而成為惡性循環(huán)［23］。可以推測(cè)，通過(guò)在老化的腸道干細(xì)胞中重新激活經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)可能是延緩衰老的作用機(jī)制之一［24］。

在 近 年 的 研 究［25-27］中 發(fā) 現(xiàn)，DNA損 傷 反 應(yīng)（DNA damage response，DDR）和p53途徑［28-29］可能在Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活導(dǎo)致干細(xì)胞的衰老的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。有學(xué)者［30］認(rèn)為激活的DNA損傷反應(yīng)可進(jìn)一步激活p53途徑，也研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷不依賴于p53，而是直接引發(fā)衰老［25］。這兩者的關(guān)聯(lián)現(xiàn)在還未完全闡明，還需繼續(xù)研究。

Insulin/IGF-1，簡(jiǎn)稱IIS，是調(diào)節(jié)機(jī)體生命周期的一條通路［31］。研究［32］顯示，在秀麗隱桿線蟲(chóng)編碼類似insulin/IGF-1的激素受體的基因daf-2可顯著延長(zhǎng)壽命，不僅如此，影響IIS通路下游成分的突變也能延長(zhǎng)壽命。在果蠅腸模型中研究發(fā)現(xiàn)抑制其腸道干細(xì)胞中的IIS通路可以延長(zhǎng)壽命［33］，而機(jī)體進(jìn)入衰老形態(tài)后，IIS失活，并且加速引起衰老［32］。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞經(jīng)常活化JNK信號(hào)通路以作為細(xì)胞保護(hù)應(yīng)答，JNK的活化可引起干細(xì)胞增殖功能增強(qiáng)［34］，然而在此過(guò)程中，子代細(xì)胞的分化缺陷升高導(dǎo)致腸上皮功能受損［35］，需要限制以確保長(zhǎng)壽。干細(xì)胞衰老的信號(hào)通路還有很多疑問(wèn)，需要繼續(xù)研究。

1.5 熱量限制對(duì)腸道干細(xì)胞衰老的影響熱量限制在延緩機(jī)體衰老以及抵御年齡相關(guān)的疾病具有顯著效果［36］。其具體機(jī)制現(xiàn)有以下說(shuō)法：禁食之后機(jī)體處于低熱量狀態(tài)，延緩年齡相關(guān)的細(xì)胞組織功能減退，所以認(rèn)為低熱量狀態(tài)對(duì)年齡相關(guān)引起的組織功能減退具有抑制作用。有研究顯示，通過(guò)研究急性脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，F(xiàn)AO）幼鼠和衰老小鼠模型，發(fā)現(xiàn)它們的ISCs功能快速提升［37］。有學(xué)者［38］認(rèn)為，F(xiàn)AO會(huì)造成丙酮酸氧化降低，這會(huì)增強(qiáng)腸道干細(xì)胞功能，另一種可能是低熱量狀態(tài)下線粒體衰老與線粒體代謝受損和FAO在許多組織中有關(guān)。研究［39］認(rèn)為，高脂飲食直接影響了ISCs與祖細(xì)胞的功能，是通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體δ，也稱為PPAR-d，信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)了腸道干細(xì)胞功能；表明熱量限制可以通過(guò)保留抗損傷儲(chǔ)備腸道干細(xì)胞池的方式增強(qiáng)腸上皮的再生能力［40］。

1.6 p53蛋白及其家族與腸道干細(xì)胞的關(guān)系p53蛋白是一種抑癌蛋白，與衰老和腫瘤的發(fā)生機(jī)制有著密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)中，端粒功能失調(diào)誘導(dǎo)p53依賴性的DNA損傷檢查點(diǎn)，包括p21的依賴性衰老［41-42］。研究表明，p53對(duì)于衰老端粒功能失調(diào)小鼠的腸上皮完整性具有正向調(diào)節(jié)作用［43］；p53會(huì)消耗攜帶斷裂DNA和染色體畸變的腸道干細(xì)胞［44］；當(dāng)DNA損傷至無(wú)法修復(fù)時(shí)，激活的p53上調(diào)促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)和線粒體細(xì)胞色素C釋放并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［45］。上述p53介導(dǎo)的DNA損傷信號(hào)通路可防止DNA損傷在細(xì)胞內(nèi)的積累，阻止新生癌細(xì)胞出現(xiàn)。從該角度而言，p53的腫瘤抑制作用對(duì)延長(zhǎng)機(jī)體生命有重要作用，而高表達(dá)p53基因小鼠出現(xiàn)組織干細(xì)胞功能下降等各種早衰表型［46］。研究證明，p53誘導(dǎo)的凋亡和衰老可能通過(guò)損耗干細(xì)胞數(shù)目和功能影響老化進(jìn)程［47］。有學(xué)者［48］也在果蠅中研究發(fā)現(xiàn)衰老過(guò)程中干細(xì)胞功能下降的同時(shí)增加了老化組織穩(wěn)態(tài)的可能性。另有研究［49］發(fā)現(xiàn)，衰老機(jī)體中的干細(xì)胞中的p53蛋白除了抑制細(xì)胞增殖還具有抑制腫瘤因子表達(dá)的作用；干細(xì)胞中的p53被激活后，其介導(dǎo)的DNA損傷信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞周期出現(xiàn)不可逆的阻滯，引起干細(xì)胞的衰老和凋亡［50］。

p21基因與p53屬于同一家族，可以通過(guò)抑制周期素依賴激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）復(fù)合物活性，將調(diào)控細(xì)胞周期與腫瘤抑制作用聯(lián)系起來(lái)并且在細(xì)胞出現(xiàn)適度DNA損傷時(shí)發(fā)揮修復(fù)作用。炎癥反應(yīng)激活p53并介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，激活的p53誘導(dǎo)CDK抑制劑p21基因轉(zhuǎn)錄，一般情況下可致細(xì)胞衰老［51］。同一家族的P16Ink4a與P19Arf（人類中的p14Arf）在衰老的機(jī)體中的表達(dá)也有所增加。

2 針灸與腸道干細(xì)胞衰老的關(guān)系

2.1 針灸延緩腸道干細(xì)胞衰老的研究思路《靈樞·九針十二原》篇云：“經(jīng)脈十二，絡(luò)脈十五。”《靈樞·本藏》篇曰：“經(jīng)脈者，所以行血?dú)舛鵂I(yíng)陰陽(yáng)，濡筋骨，利關(guān)節(jié)者也。”經(jīng)絡(luò)的作用就是運(yùn)行全身氣血、聯(lián)絡(luò)臟腑官竅、溝通上下內(nèi)外。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者［52］認(rèn)為經(jīng)絡(luò)的巡行走向與干細(xì)胞巢的分布有著密切的關(guān)系，具體來(lái)說(shuō)不同器官的干細(xì)胞巢的分布構(gòu)成了經(jīng)絡(luò)，刺激該臟腑的經(jīng)絡(luò)可沿著循行走向到達(dá)病處進(jìn)行修復(fù)。

不論在西方醫(yī)學(xué)還是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論中，衰老都是一種整體性的變化，腸道作為重要的消化器官，ISCs作為腸道上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)“基礎(chǔ)”，其衰老對(duì)于系統(tǒng)的老化進(jìn)程有著不可忽視的影響。LEI等［53］研究發(fā)現(xiàn)，ISCs與腸上皮細(xì)胞下肌成纖維細(xì)胞有很緊密的聯(lián)系，主要表現(xiàn)為可以調(diào)節(jié)局部?jī)?nèi)環(huán)境繼而影響腸道干細(xì)胞。據(jù)這份研究結(jié)果可以推測(cè)，針灸調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞的影響因子繼而間接調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞衰老進(jìn)程的研究。

2.2 針灸干預(yù)信號(hào)通路延緩腸道干細(xì)胞衰老近年來(lái)，針灸在信號(hào)通路層面對(duì)于機(jī)體正向性調(diào)節(jié)作用的研究較多，前面闡述了腸上皮細(xì)胞增殖主要的動(dòng)力來(lái)源是Wnt通路激活，增殖的來(lái)源是腸道干細(xì)胞，所以腸道干細(xì)胞衰老、機(jī)體系統(tǒng)性衰老和Wnt信號(hào)通路被抑制激活這三者相互影響。JNK通路上調(diào)導(dǎo)致干細(xì)胞增殖增加的過(guò)程中，相關(guān)干細(xì)胞的子代細(xì)胞分化出的缺陷明顯增加，可使腸上皮細(xì)胞功能受損。前面提到導(dǎo)致衰老是一種協(xié)同作用，而同種延緩衰老的干預(yù)方式也可能同時(shí)在不同的通路中發(fā)揮了作用，如果將針灸作為干預(yù)ISCs中Wnt信號(hào)通路的手段，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)其延緩衰老的作用機(jī)制。

2.3 針灸干預(yù)衰老腸道炎性環(huán)境延緩腸道干細(xì)胞衰老有學(xué)者［54-55］認(rèn)為腸道的衰老過(guò)程伴隨著慢性、低度的炎癥狀態(tài)。因此腸道內(nèi)環(huán)境發(fā)生不平衡且持續(xù)的損傷，影響機(jī)體的衰老；針灸在細(xì)胞-體液免疫方面的調(diào)節(jié)機(jī)制主要表現(xiàn)在調(diào)整機(jī)體的免疫功能，使衰老過(guò)程中免疫功能得以趨近于正常［56］。故為針灸延緩衰老提供了依據(jù)，這種炎癥狀態(tài)可能對(duì)ISCs有一定影響，所以理論上針灸可以延緩腸道的衰老過(guò)程。

3 小結(jié)

自古以來(lái)，延緩衰老都是人類的共同希望，針灸不僅在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有舉足輕重的地位，而且在延緩衰老方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)有關(guān)研究很多，然而已有的研究尚未涉及到腸道干細(xì)胞的層面中，當(dāng)然，已經(jīng)有越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明一些單獨(dú)的機(jī)制學(xué)說(shuō)之間有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。但是關(guān)于針灸干預(yù)腸道干細(xì)胞衰老的機(jī)制研究方面還是空白，所以從該角度入手研究，可能會(huì)有新的發(fā)現(xiàn)，從而為人類抗衰老、延緩衰老研究進(jìn)程提供一條途徑。