骨髓間充質干細胞成骨分化的研究進展

李強強，謝亞東，楊國清 ，梁文強，張懷斌，王勇平

(1.蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730030； 2.蘭州大學第一醫院骨科，蘭州 730030)

骨髓由非貼壁的造血細胞和貼壁的基質細胞構成，其中貼壁的基質細胞包含多能間充質干細胞、分化的骨髓間充質基質細胞。間充質干細胞主要依賴增殖分化完成自我更新，其具有多向分化潛能[1-2]，在特定誘導條件下，可向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、成纖維細胞分化[3]。如何定向誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化非常重要，其可為骨折修復、骨組織工程、骨質疏松等提供治療方法。骨缺損、骨損傷屬于骨科常見疾病，通常需要植骨治療。植骨治療包括異體骨移植修復和自體骨移植修復，其中自體骨移植療效較好，不存在免疫反應，但自體骨供應受到一定限制；同種異體骨移植修復的缺點為移植骨存在免疫原性和致病性，最終導致骨損傷修復難以獲得滿意效果。研究發現，骨髓間充質干細胞具有多向分化潛能，可選擇一系列誘導方式促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化[4]。骨髓間充質干細胞可分化成多類組織細胞，且細胞免疫原性較弱，極易轉染外源基因，成為組織工程研究的熱點，同時其也在基因與細胞治療領域展現出廣闊的應用前景。鑒于骨髓間充質干細胞存在以上諸多優點，其有望成為骨缺損修復的理想種子細胞。現就骨髓間充質干細胞成骨分化的研究進展進行綜述，以期為后續研究提供理論基礎。

1 骨髓間充質干細胞

20世紀60年代有學者發現，骨髓中不僅有造血干細胞，還包含非造血系統多向分化的干細胞[5-6]。隨著學者對骨髓基質進一步研究發現，骨髓基質細胞系統可隨著造血干細胞系統一同成長，并能夠完成自我更新，在一定條件下可分化為成骨細胞、網狀細胞、成纖維細胞或脂肪細胞等間充質組織細胞群，因此將這類貼壁生長的骨髓單核細胞稱作骨髓基質干細胞[7]。另有研究顯示，骨髓間充質干細胞主要來源于間質系統的多能干細胞，其與造血干細胞共同分布在骨髓內，并保證骨髓的動態穩定[8]。骨髓間充質干細胞作為骨髓中常見的非造血干細胞，在體內外均可達到支撐與調控造血的目的[9]。有學者指出，若骨髓間充質干細胞缺失或功能受損，機體發生骨關節炎性疾病的風險增高[10]，其原因可能為：①骨髓間充質干細胞的數量、活力可隨著年齡增長而不斷減少和降低；②骨髓間充質干細胞喪失對周邊調節信號的反應能力；③骨髓間充質干細胞的微生態環境受到影響，從而引發功能失衡；④免疫調節能力異常；⑤分化功能衰退等。骨髓間充質干細胞來源廣泛，最初在骨髓內發現，隨后在臍帶血、脂肪組織、胚胎組織、外周血以及肝臟內也發現骨髓間充質干細胞的存在。

2 骨髓間充質干細胞的分離培養與鑒定

2.1骨髓間充質干細胞的分離培養 骨髓間充質干細胞具有取材方便、體外培養增殖能力較強、極易定向分化為成骨細胞等優勢，特別是自體骨髓間充質干細胞，其可抑制T細胞增殖，具有預防免疫應答、降低免疫原性的作用，是目前臨床較為理想的骨種子細胞。雖然骨髓間充質干細胞取材較為簡便，但在骨髓中含量較低。研究顯示，骨髓間充質干細胞僅占骨髓單個核細胞的0.000 1%～0.01%[11]，因而難以滿足組織工程種子細胞的需求，往往需要通過體外分離純化才能達到大量擴增的效果。

目前骨髓間充質干細胞的分離方式較多，有流式細胞術分選法、免疫磁珠法、密度梯度離心法、全骨髓貼壁法等，其中流式細胞術分選法和免疫磁珠法可通過熒光、磁珠標記骨髓間充質干細胞表面抗原，具備操作簡便、分選快速、精確度高等優勢，但在分選期間可能導致細胞受損或死亡，加上儀器設備較為昂貴，操作期間需要的細胞數量較多，因此在臨床的應用受到限制[12]。密度梯度離心法雖然操作簡便，但極易導致原始骨髓間充質干細胞微環境受損，因此難以形成骨髓間充質干細胞集落。全骨髓貼壁法對細胞的傷害較小，且細胞增殖速度較快，經過培養可獲得具有較高活性和純度的骨髓間充質干細胞，故成為臨床較為常見且簡單便捷的體外培養方式之一[13-14]。

2.2骨髓間充質干細胞的鑒定 鑒定骨髓間充質干細胞的方法較多，但尚未統一，目前多采用免疫熒光染色法、流式細胞術，同時也可選擇倒置顯微鏡觀察細胞的形態變化，從而達到輔助鑒別骨髓間充質干細胞的目的。骨髓間充質干細胞存在多種表面抗原，但缺少特異性表面標志物。由于骨髓內包含造血干細胞、骨髓間充質干細胞，而骨髓間充質干細胞通常僅表達CD44、CD73、CD90、CD105等表面標志物，不表達造血細胞的表面標志物CD14、CD45、CD19、CD34及白細胞相關抗原[15-17]。因此利用流式細胞術給予熒光標記的單克隆抗體進行細胞分選，有助于與造血干細胞區分[18-19]。另外還可根據骨髓間充質干細胞的多向分化潛能進行間接鑒定，在特定的誘導條件下，骨髓間充質干細胞能向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等分化[3]。綜上，可將細胞形態、表面標志物、多向分化能力三者結合鑒定骨髓間充質干細胞。

3 骨髓間充質干細胞成骨分化的影響因素

隨著研究的不斷深入，骨髓間充質干細胞體外分離純化、培養擴增與鑒定技術均取得了較大的進展，骨髓間充質干細胞成骨誘導分化主要依靠成骨誘導培養基，而成骨誘導培養基的組成成分包括地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉，三者存在劑量與時間相關性[20]。目前影響骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的因素較多，主要包括化學因素(成骨細胞培養基、枸橘苷、淫羊藿苷、駱駝蓬堿等)、生物因素(骨形態發生蛋白、前列腺素E2受體選擇性激動劑等)、物理因素(電磁場、沖擊波等)以及生物材料(纖維增強復合水凝膠納米復合材料、多孔硅酸鈣陶瓷材料、醫用鎂合金材料等)[21]。

3.1生物材料 近年來學者發現，生物材料在骨形態發生蛋白的表達中具有重要意義，同時還可促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞增殖分化[22]。有研究將鍶元素置于多孔硅酸鈣陶瓷材料離子提取物中與骨髓間充質干細胞進行復合培養發現，多孔硅酸鈣陶瓷材料產生的硅、鍶元素可明顯提升骨髓間充質干細胞成骨基因、信使RNA的表達水平[23]。目前用于骨科植入的生物修復材料主要分為高分子材料和金屬材料兩大類，其中金屬材料有不銹鋼、鈦合金、鈷基合金、鐵基合金等，但這些金屬材料長期置入宿主體內易與周圍組織發生電解質腐蝕，產生不良反應和局部炎癥，造成生物相容性差，發生骨溶解[24]。以上缺陷無論發生哪一種，均可導致骨損傷修復效果不佳，甚至失敗。高分子材料包括生物陶瓷和天然聚合物，由于它們在生物學性能及結構上與宿主機體結構存在一定差異，骨損傷修復效果不佳。因此，急需開發一種新型醫用骨修復材料，以滿足臨床需求。

近年來，醫用新型生物材料鎂合金成為研究熱點。研究顯示，鎂離子能促進骨細胞形成并加速骨組織愈合，且參與機體多種酶的活化、蛋白質合成、肌肉收縮等[25]。隨著研究的深入發現，置入鎂金屬內植物與宿主不會發生明顯的炎癥反應，且能促進骨折斷端骨痂形成，但純鎂材料腐蝕速率過快，無法達到人體支持骨折愈合需求，而鎂金屬合金的機械完整性和耐腐蝕性均優于純鎂[26]。鎂合金是一種新型金屬材料，其可作為心腦血管支架材料以及骨科植入材料[27]，目前關于鎂合金對骨髓間充質干細胞生物學行為影響的相關報道較少。鎂合金在促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化中具有重要意義，與其他生物金屬材料相比，鎂合金具有可降解性，與機體有較好的生物相容性，且具有骨整合、促進骨生成的作用。

鎂具備一定降解性、生物相容性和力學性能，鎂或鎂合金作為骨科新型內植物材料，在骨再生的關鍵細胞骨髓間充質干細胞成骨分化中具有重要作用。研究發現，純鎂在機體中的降解速度較快，可直接降低治療效果，加入鋁、硅、鈣或錳等金屬元素后，可提升鎂金屬的耐降解性[28]，且不會增加不良反應，同時還可改善與機體內組織的相容性[29]。研究發現，鎂合金表面具有一定黏附性能，隨后對其細胞毒性進行探究發現，鎂合金浸提液可能對骨髓間充質干細胞產生細胞毒性作用，但若能夠進行微弧氧化表面改性，則可有效降低鎂合金對骨髓間充質干細胞的毒性作用[30]。Lee等[31]對鎂合金的生物學性能進行研究發現，鎂合金材料均存在一定的細胞毒性，對其浸提液進行pH值調整發現，細胞增殖活性較好。在骨科可利用鎂合金制備成界面螺釘置于機體中，利用鎂合金的降解性與骨整合功效促進骨愈合，同時減少翻修手術的次數，降低對患者的傷害，為快速穩定病情提供保障[32]。體外實驗證實，將鎂合金置于骨髓間充質干細胞的培養基中進行培養，利用掃描電鏡進行觀察發現，鎂合金表面有大量細胞依附，且生長狀態較好，提示鎂合金有助于骨髓間充質干細胞的黏附生長，進而誘導成骨樣細胞的成骨分化，達到骨誘導目的[33]。研究發現，加入適量的鎂合金浸提液可使成骨分化的標志物堿性磷酸酶的表達水平明顯升高，而骨橋蛋白基因表達水平也呈現升高趨勢[34]，但關于鎂合金對成骨分化基因表達作用的影響還需進一步研究。

目前，鎂合金作為內植物應用于骨科還有很多問題需要解決，其中最主要的問題為鎂合金降解速率的不可控性。有效解決的方法包括：①表面涂層，如磷酸鈣涂層和羥基磷灰石涂層，其應用廣泛，涂層后鎂合金降解速率控制效果顯著；②改善鎂合金成分，特定金屬元素與鎂合金化，金屬元素通過結合反應提升材料的強度、耐腐蝕能力以及降低合金材料降解速率。但上述研究均處于實驗階段，鎂及鎂合金作為適宜的骨內固定物材料需滿足一定的力學強度要求，且降解過程可控并允許骨長入，利于骨折愈合，故未來還需深入研究。

3.2其他 近年隨著中醫技術的迅猛發展發現，部分中藥成分能夠促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，同時有助于修復骨缺損。報道顯示，淫羊藿苷+成骨誘導培養基能夠共同促進成骨細胞增殖分化[35]；補骨脂素+成骨誘導培養基可通過調節骨鈣素、Runt相關轉錄因子2蛋白的表達，進而促進骨髓間充質干細胞成骨分化[36]。富血小板血漿可有效促進骨髓間充質干細胞的增殖分化。研究顯示，在骨髓間充質干細胞成骨誘導培養基中加入富血小板血漿可促進骨髓間充質干細胞增殖，且誘導成功的成骨細胞堿性磷酸酶染色強陽性，成骨分化相關蛋白(如骨橋蛋白)信使RNA表達增加[37]。此外，激素在促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞增殖分化中也具有較重要的作用，研究發現，向成骨誘導培養基中加入17β-雌二醇，成骨分化過程中堿性磷酸酶的表達水平明顯升高[38]。

4 成骨細胞的鑒定

目前對于骨髓間充質干細胞經誘導后分化形成的成骨細胞主要依據成骨細胞的特征鑒定，如分泌Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶以及是否形成礦化結節等。其中對于堿性磷酸酶，可利用改良鈣鈷法染色鑒定。研究顯示，骨髓間充質干細胞經誘導后堿性磷酸酶可出現明顯升高的現象，使用改良鈣鈷法染色后礦化位置可見棕黑色或黑色沉淀或結節[39]。在動物實驗中，大鼠骨髓間充質干細胞的表型免疫細胞經過化學染色后，其第三代骨髓間充質干細胞成骨標志物CD54、CD44及纖連蛋白抗原抗體反應呈陽性，而陽性反應物呈棕色或棕褐色，廣泛分布在胞質內，尤其是胞核周邊，提示骨髓間充質干細胞具有成骨分化的潛能[40]。骨髓間充質干細胞成骨誘導培養14 d后，學者采用免疫組織化學測定成骨標志物——骨連接素、骨橋素的表達發現，細胞核呈淡藍色，胞質中存在較多棕黃色顆粒，提示成骨誘導分化成功[41]。骨髓間充質干細胞在成骨誘導體系作用2周后，Ⅰ型膠原免疫組織化學染色后顯示陽性反應，細胞質顯示棕褐色，而Ⅲ型膠原免疫組織化學染色顯示陰性反應，說明骨髓間充質干細胞成骨分化后主要分泌Ⅰ型膠原蛋白[42]。骨鈣素又稱為γ-羥基谷氨酸蛋白，常被作為成熟的成骨細胞合成維生素K依賴酶修飾的骨非膠原蛋白，在成骨細胞表型發育期間，骨鈣素的表達顯示發育階段特異性，故其僅在基質礦化期開始后表達。

5 結 語

骨髓間充質干細胞可用于組織工程、干細胞移植、骨缺損修復、骨質疏松癥以及骨折不愈合等，具有較大價值。骨髓間充質干細胞來源較少且缺乏分離純化方法，目前亟須建立一種體外分離純化方式，以達到大量擴增骨髓間充質干細胞的目的。促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的方式較多，如何選擇一種穩定并可在臨床推廣使用的方式還需進一步研究；利用生物材料復合骨髓間充質干細胞作為骨填充材料治療骨缺損的研究取得了一定進展，但是由于生物材料存在降解速率過快、生物學性能不穩定、骨組織不匹配、不能建立有效的連接血供等缺陷，仍需多方面深入研究。