胚胎發(fā)育潛能的評估方法及應用價值

王芳，李紅義，胡春秀

(武裝警察部隊特色醫(yī)學中心軍人生殖醫(yī)學科，天津 300162)

全球約15%的育齡夫婦受到不孕癥困擾[1]，而中國約有13.6%的新婚育齡夫婦婚后1年不孕[2]。輔助生殖技術廣泛應用于不孕癥的治療，但多胎妊娠率高達30%以上[3]，較高的多胎妊娠率增加了患者的心理負擔和家庭、醫(yī)院、社會的經(jīng)濟成本[4]。目前，解決高多胎妊娠率、實現(xiàn)高單胎活產(chǎn)率的最佳方案是選取最具發(fā)育潛能的單個優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植，從而達到優(yōu)生的目的[5]。形態(tài)學評分是評估卵子和胚胎發(fā)育潛能最常用的方法，但其具有單一時間點觀察、主觀因素影響大、對著床結局的預測不準確等缺點[6]。延時攝像技術可連續(xù)觀察胚胎的成長過程，當結合計算機的分析功能時，可為未來自動篩選胚胎提供可能[7]。胚胎植入前遺傳學檢測(pre-implantation genetic testing，PGT)技術，尤其是針對非整倍體的遺傳學檢測，可為降低流產(chǎn)率、提高妊娠率以及有效阻斷致病基因的垂直傳播提供參考[8]。非侵入性的代謝組學評估能反映細胞的功能是否正常，為篩選潛能胚胎提供新的“窗口”[9]。以上方法對胚胎發(fā)育潛能的評估各有優(yōu)點，現(xiàn)就其進展情況予以綜述。

1 基于形態(tài)學的胚胎評估方法

1.1傳統(tǒng)形態(tài)學評估和囊胚培養(yǎng)技術 目前，國內(nèi)外胚胎實驗室仍廣泛采用傳統(tǒng)的形態(tài)學評分預測胚胎發(fā)育潛能。在每天特定的時間對胚胎進行形態(tài)學觀察，原核數(shù)目和形態(tài)、卵裂球數(shù)目、碎片程度及卵裂球大小的均一性等被作為評估胚胎發(fā)育潛能是否良好的指標[6]。此外，胚胎胞質(zhì)中的空泡、粗顆粒區(qū)域聚集、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集、每個卵裂球中出現(xiàn)的多核等現(xiàn)象也引起了胚胎學家的重視，但其對妊娠結局的影響仍不明確，是否可作為胚胎發(fā)育潛能評估的補充指標仍有待進一步研究。

隨著胚胎培養(yǎng)技術日益成熟，胚胎培養(yǎng)成囊胚再行移植成為胚胎實驗室的常規(guī)操作。事實上，囊胚培養(yǎng)本身也可對胚胎發(fā)育潛能進行評估，在培養(yǎng)至第3天時，胚胎基因組被部分激活，發(fā)育潛能較好的胚胎可繼續(xù)發(fā)育成囊胚，較差的則發(fā)生退化，即完成了胚胎的自我篩選[10-11]。隨機對照研究顯示，經(jīng)過囊胚的再次篩選，患者可獲得更好的妊娠結局[12-13]。與卵裂期胚胎移植相比，新鮮移植周期和解凍移植周期的囊胚移植均有更高的臨床妊娠率和活產(chǎn)率[12]；且在全胚冷凍周期中，解凍囊胚首次移植的活產(chǎn)率也顯著高于卵裂期胚胎[13]，因此囊胚移植被廣泛應用于臨床實踐。

然而，學者針對囊胚移植的研究仍有不同結論。Martins等[10]研究顯示，囊胚移植和卵裂期胚胎移植的活產(chǎn)率、臨床妊娠率和累積妊娠率比較差異均無統(tǒng)計學意義。亦有研究顯示，囊胚移植與早產(chǎn)、低出生體重兒和小胎齡兒的風險增加有關[14]，且其圍生兒死亡率和新生兒并發(fā)癥發(fā)生率均高于卵裂期胚胎移植[15]。美國生殖醫(yī)學學會提出囊胚培養(yǎng)技術可能與單卵雙生和新生兒的不良結局發(fā)生率的小幅增加有關[16]。以上研究提示，囊胚移植可能與圍生期及新生兒的不良結局有關。因此，需要更多加強囊胚移植患者的孕后管理和監(jiān)測。

綜上所述，囊胚移植可獲得更高的植入率，其中單囊胚移植可減少胚胎移植數(shù)量，降低多胎妊娠率。然而，囊胚移植也具有一定的風險，如無胚胎移植、新生兒不良結局等，且囊胚移植并不能避免由染色體異常引發(fā)的流產(chǎn)問題等。因此，是否進行囊胚移植仍需綜合臨床多種因素考慮。

1.2延時攝像技術 傳統(tǒng)的形態(tài)學評估會使胚胎暴露在不穩(wěn)定的溫度和pH值條件下，對胚胎存在潛在的有害影響，且僅限于在每天的特定時間進行一次評分，可能會忽略胚胎動態(tài)發(fā)育中的某些關鍵階段[9]。為更清晰地了解胚胎發(fā)育的全過程，延時攝像技術應運而生，其在2009年應用于臨床，可在穩(wěn)定培養(yǎng)條件下，連續(xù)、定時地監(jiān)測卵子及胚胎的成長過程，獲取豐富的視頻數(shù)據(jù)，為全面評估胚胎的發(fā)育潛能提供了新方法，也為胚胎篩選提供了更多、更細致的研究數(shù)據(jù)[17]。

一項多中心研究表明，應用延時攝像技術篩選胚胎可使臨床妊娠率增加約20%[18]，表明延時攝像技術可以提高胚胎篩選的成功率，改善臨床結局。此外，延時攝像技術與其他技術結合具有更好的胚胎篩選效果，如Rocafort等[19]研究顯示，延時攝像技術與PGT結合是篩選最佳植入潛能的整倍體胚胎的有效方法。但延時攝像技術也存在一些問題，其形態(tài)動力學參數(shù)的定義注釋并不精確，可造成不同操作者因對參數(shù)的理解差異而產(chǎn)生結果誤差[20]。有研究者引入計算機深度學習模型，利用延時攝像技術獲取大量視頻數(shù)據(jù)，建立學習模型進行信息組合分析，形成嚴格的胚胎評估分級，提升胚胎篩選的自動化和標準化[21]。

然而，有學者對延時攝像技術的使用持有不同見解。Faramarzi等[22]研究顯示，使用延時攝像技術對卵子的形態(tài)動力學參數(shù)(包括卵胞質(zhì)形態(tài)、透明帶寬度、卵周隙大小、第一極體形態(tài))及胚胎形態(tài)動力學參數(shù)(包括第二極體排出時間、原核形態(tài)、原核消失時間、2～8個細胞的形成時間及卵裂發(fā)生的時間)進行綜合評估篩選胚胎后，無法有效改善二代試管嬰兒的胚胎發(fā)育結局。此外，延時攝像技術對胚胎進行高頻率的曝光拍照時，其所用的短波光對胚胎的影響以及使用該技術的長期安全性也有待進一步研究論證。

可見，延時攝像技術可提供新的胚胎觀察模式，實現(xiàn)在穩(wěn)定環(huán)境中對胚胎的實時觀測，顯示傳統(tǒng)觀察無法顯示或忽視的細節(jié)，提供對胚胎活力評估有重要意義的動態(tài)參數(shù)，如Coticchio等[20]利用延時攝像技術研究受精事件的形態(tài)動力學參數(shù)，結果顯示，胞質(zhì)暈消失與原核破裂的時間間隔可以預測卵裂球數(shù)目及碎片情況，且此項技術與其他技術結合運用，可為未來胚胎潛能評估和篩選提供新的方向。但對延時攝像技術的安全性以及盡快建立關于延時攝像技術的有效胚胎評估體系，需進一步的探索和研究。

2 PGT

PGT是在胚胎移植前篩查胚胎染色體，以排除攜帶遺傳疾病及染色體異常胚胎的檢測方法。隨著輔助生殖技術的進步，PGT可利用胚胎卵裂球、囊胚滋養(yǎng)層細胞及胚胎培養(yǎng)基中的無細胞DNA等評估和篩選胚胎，為基因或染色體異常患者帶來希望[8]。PGT可通過多種技術手段實現(xiàn)，包括熒光原位雜交法技術、基因組雜交微陣列技術、實時熒光定量聚合酶鏈反應技術、高通量測序技術等。目前，PGT已用于鑒定200多種遺傳性疾病，其適應證包括常染色體隱性疾病、常染色體顯性疾病、性染色體連鎖疾病、具有重要延遲發(fā)育的遺傳突變、染色體結構異常、染色體數(shù)目異常、線粒體疾病以及醫(yī)學原因進行的性別選擇[23]。其中非整倍體植入前基因檢測(pre-implantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)技術應用最為廣泛，主要適用于高齡婦女、不明原因復發(fā)性流產(chǎn)及反復胚胎種植失敗患者的胚胎篩選[24]。

2.1侵入性的PGT-A 對從卵子、受精卵中移除的極體或胚胎細胞(包括卵裂球細胞、囊胚滋養(yǎng)層細胞)進行活檢是目前評價胚胎染色體的整倍體性較為可靠的方法。由于極體活檢存在無法提供父系遺傳信息的缺陷，卵裂球細胞活檢僅能獲取極少量遺傳物質(zhì)(1～2個細胞)，常導致基因擴增失敗及卵裂球活檢損傷胚胎活力等問題，因此臨床較多使用侵入性的PGT-A進行基因檢測，其優(yōu)勢在于能采集更多的細胞(5～10個)進行DNA分析，避免卵裂期活檢對胚胎繼續(xù)生長發(fā)育的影響，且可在囊胚階段淘汰部分非整倍體胚胎，使檢測結果更為準確[25]。目前，侵入性的PGT-A較常采用的檢測方式為利用囊胚滋養(yǎng)層細胞進行基因組DNA提取與擴增，再通過高通量測序技術進行分析。一項隨機對照研究顯示，單個整倍體胚胎移植可顯著提高活產(chǎn)率，降低流產(chǎn)率和多胎妊娠率[26]；在高齡(40～43歲)女性患者中移植整倍體胚胎，也可獲得較高的種植率和活產(chǎn)率[27]。可見，經(jīng)過PGT-A篩選后的整倍體胚胎，移植后能獲得更優(yōu)良的臨床妊娠結局。

但PGT-A也存在以下問題亟待解決：①嵌合體現(xiàn)象對結果準確性的影響。嵌合體是在兩個及以上基因上存在不同細胞譜系的現(xiàn)象，約32%的人類胚胎存在嵌合體，且整倍體/非整倍體嵌合的發(fā)生率可高達17%[28]。由于囊胚活檢僅使用較少的滋胚層細胞，不能囊括全部的染色體位點，因此其檢測結果無法反映最終形成胎兒的內(nèi)細胞團的基因組特征，極大可能會出現(xiàn)誤檢或漏檢的情況。誤檢導致丟棄大量正常胚胎，有研究顯示丟棄正常胚胎的比例可高達40%[29]。有文獻報道，移植PGT-A為異常的胚胎后，患者生出健康胎兒[30]，提示存在誤檢的可能性。相反，移植漏檢胚胎可能會導致不孕或畸形胎兒的出生，造成患者巨大的物質(zhì)和精神損失。②活檢操作技術的差異性可導致PGT-A結果的不確定性。囊胚活檢需要經(jīng)過專業(yè)培訓的人員通過專門的設備執(zhí)行操作，以保護胚胎的生存能力，操作人員的技術差異可直接影響結果的準確性[31]。③目前仍沒有關于囊胚活檢安全性的長期數(shù)據(jù)，如活檢操作是否會導致印跡基因紊亂等，因此侵入性PGT-A技術的安全性仍需進一步研究。

雖然基于卵裂球和滋養(yǎng)層細胞活檢的PGT可實現(xiàn)健康孕育的目的，但上述困難仍未得到很好解決。因此，PGT的發(fā)展取決于其診斷的準確性和安全性。隨著分子生物學診斷方法的不斷發(fā)展及人類基因組遺傳信息的不斷完善，PGT可能會克服現(xiàn)有的難題，帶來臨床獲益。

2.2非侵入性PGT-A(non-invasive pre-implantation genetic testing for aneuploidy，niPGT-A) 理想的胚胎評估方法是無創(chuàng)、非侵入性的，不影響胚胎正常培養(yǎng)，不直接造成胚胎損傷。niPGT-A是一種非侵入性檢測技術，用于分析廢棄的胚胎培養(yǎng)基和囊胚腔中微量的游離DNA，從而獲取染色體拷貝數(shù)信息[32]。該技術的優(yōu)勢是可利用細胞游離DNA，游離DNA易于獲取，且此方式對胚胎損傷的風險較低。研究顯示，在胚胎培養(yǎng)第3天和第5～7天均能檢測到游離DNA，且隨著時間的推移，培養(yǎng)基中的游離DNA逐漸增多，niPGT-A的結果也更加準確[33]。此外，Huang等[34]研究證實，胚胎培養(yǎng)基中游離的DNA能反映囊胚滋養(yǎng)層和內(nèi)細胞團的倍性信息；該研究結果還顯示，在去除所有卵冠丘復合物后，niPGT-A的假陰性率為0%；當選擇合適的嵌合體閾值后，niPGT-A的陽性預測值和特異度均遠高于囊胚滋養(yǎng)層活檢的PGT-A，表明niPGT-A結果更為可靠。

然而，有研究表明對胚胎培養(yǎng)基進行niPGT-A所獲得的胚胎染色體倍性一致率遠低于對滋養(yǎng)層細胞進行PGT-A[35]，這可能由于胚胎培養(yǎng)基中的游離DNA水平低于滋養(yǎng)層細胞樣本，造成擴增效率較低。但目前相關臨床研究較少，尚不能判斷胚胎培養(yǎng)基的niPGT-A是否能帶來臨床獲益。

囊胚腔液樣本的niPGT-A是建立在囊胚腔穿刺的基礎上，雖具有一定的侵入性，但對胚胎的整體損傷較小，具有較好的臨床應用前景。Magli等[36]對256例囊胚腔液樣本采用全基因測序和微陣列比較基因組雜交技術，結果顯示，71%的囊胚腔液樣本成功擴增，其中87%提供了有信息的染色體拷貝數(shù)結果，倍性一致率為93.6%，證實利用囊胚腔液DNA能獲得較準確的細胞遺傳學評估。同時，該研究也證實了囊胚腔液游離DNA作為PGT-A擴增模板的可行性。然而，來自12對夫婦共23例囊胚腔穿刺樣本和囊胚滋養(yǎng)層活檢樣本的研究顯示，僅有34.8%的囊胚腔液樣本成功實現(xiàn)全基因組測序；且在獲得染色體拷貝數(shù)數(shù)據(jù)的9例樣本中，只有37.5%的樣本顯示與對應的滋養(yǎng)層活檢完全一致的核型[37]，此數(shù)據(jù)仍未達到臨床應用的要求。

無論是對胚胎培養(yǎng)基樣本還是囊胚腔液樣本，niPGT-A主要存在兩個共性問題：①如何穩(wěn)定且準確地從胚胎培養(yǎng)基或囊胚腔液中獲得適合遺傳分析的足量DNA模板；②仍需進一步研究胚胎DNA釋放的機制，以確定從囊胚腔液和胚胎培養(yǎng)基中獲得的DNA能真實反映相應胚胎的遺傳學特征。若能解決以上問題，niPGT將成為一種更簡單、安全、可靠的PGT方法；且成本更低，臨床獲益較大。

3 代謝組學

代謝組學是繼基因組學后被認為有效、非侵入性、可用于評估胚胎活力的生物學指標，是對生物細胞、組織或器官等樣本中的低分子量代謝產(chǎn)物進行定性和定量分析的學科[38]。由于代謝組學可提供關于細胞內(nèi)代謝的有效信息，且檢測種類少，檢測時間短，因此引起研究者的廣泛關注。作為“細胞功能的信息提供者”，代謝組學研究可呈現(xiàn)細胞對外界環(huán)境的反應，體現(xiàn)細胞、組織或有機體的功能表型，從而揭示細胞的實際功能狀態(tài)，獲得較基因組學、轉錄組學或蛋白組學更多潛在的直接信息[9]。但目前代謝組學分析在胚胎發(fā)育潛能評估中的應用尚處于起步階段，物質(zhì)代謝圖譜與妊娠結局的相關性仍有待深入研究。

3.1代謝組學分析技術 代謝組學常用的分析方法有4種，即核磁共振技術、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術和近紅外光譜分析技術。核磁共振技術能夠實現(xiàn)對樣品的無偏向性、無創(chuàng)性檢測分析，但其價格較為昂貴，且使用光譜分析技術檢測豐度較低的化合物較為困難[39]，故其在臨床應用受限。Kirkegaard等[40]研究顯示，用核磁共振技術分析第3天和第5天的胚胎培養(yǎng)基，不能預測預后良好患者的妊娠結局，這可能由于胚胎培養(yǎng)基中的代謝物濃度過低，核磁共振技術無法進行有效檢測。

基于色譜技術的兩種方法各有優(yōu)點。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術具有較強的鑒定能力，分析快速方便，可同時檢測大分子量化合物和熱不穩(wěn)定化合物等，但缺點在于無商品化圖譜作為參照物，只能自行建庫[41]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術具有較為成熟的商品化水平，主要用于小分子易揮發(fā)的化合物，且靈敏度高、重復性好，但其檢測樣品必須能夠氣化，無法對熱不穩(wěn)定和難揮發(fā)物質(zhì)進行分析[42]。

近紅外光譜分析技術主要基于近紅外光譜中豐富的羥基和氫鍵信息，變化的光譜可以反映物質(zhì)結構的改變或水與溶質(zhì)之間的相互作用，在分子層面獲取豐富的信息[43]。有研究使用近紅外光譜法測定新鮮或解凍胚胎培養(yǎng)基的代謝譜，結果顯示，胚胎生存指數(shù)單獨使用或與形態(tài)學評分結合使用，較單獨的形態(tài)學評分對胚胎植入結局的預測更加客觀可靠[44]。但另一項研究顯示，應用近紅外光譜法進行的代謝組學分析存在組內(nèi)變異，會導致假陽性和假陰性的發(fā)生[45]，因此需謹慎使用。

隨著科技的不斷進步，將涌現(xiàn)出更有潛力的代謝組學分析技術，如拉曼光譜技術，但新技術仍在不斷的摸索和嘗試中，其成熟應用于臨床仍需大量的數(shù)據(jù)積累和支持。

3.2代謝組學分析成分 代謝組學研究是對胚胎培養(yǎng)液、囊胚腔液及女性生殖道各種生物液體(卵泡液、子宮內(nèi)膜液等)中存在的小分子、非蛋白質(zhì)類化合物進行系統(tǒng)的分析，確定、量化與正常及病理狀態(tài)相關的代謝物，從而預測胚胎發(fā)育潛能。目前主要檢測物質(zhì)包括葡萄糖、丙酮酸、氨基酸以及部分細胞因子(可溶性人白細胞抗原、胰島素樣生長因子等)。

胚胎在早期以丙酮酸和乳酸代謝為主要代謝底物，囊胚期以葡萄糖為主要代謝底物，因此，丙酮酸和葡萄糖的代謝水平常被用作胚胎發(fā)育潛能評估指標之一。宋蕊等[46]研究顯示，在培養(yǎng)第3天，對葡萄糖利用度高的胚胎可促進囊胚形成，提示胚胎具有更高的發(fā)育潛能，但在培養(yǎng)第3天和第5天時，胚胎對丙酮酸的利用程度與囊胚形成無關。李晨陽[38]研究顯示，在胚胎發(fā)育第3天，與劣質(zhì)胚胎組相比，優(yōu)質(zhì)胚胎組存在包括L-谷氨酰胺在內(nèi)的10個顯著性差異的代謝物。可溶性人白細胞抗原同樣可作為胚胎發(fā)育潛能評估指標之一，研究顯示，當人類胚胎培養(yǎng)液中缺乏可溶性人白細胞抗原時，可導致胚胎發(fā)育異常和妊娠率降低；當培養(yǎng)液中可溶性人白細胞抗原處于高表達水平時，胚胎的臨床妊娠率和種植率更高[47]。體外培養(yǎng)胚胎時，胚胎分泌至培養(yǎng)液中的胰島素樣生長因子可促進囊胚攝取葡萄糖，進而促進胚胎生長發(fā)育，故培養(yǎng)液中的胰島素樣生長因子水平可作為評估胚胎發(fā)育潛能的指標之一[48]。

由于代謝組學發(fā)展時間較短，多數(shù)實驗僅為單中心研究，檢測條件及方法無法標準化，尚不能確定胚胎發(fā)育潛能評估的特異性生物標志物。一項對隨機對照研究結果的薈萃分析顯示，仍缺乏足夠的證據(jù)證實代謝組學評估能夠有效改善臨床妊娠率和活產(chǎn)率[49]。因此，代謝組學在胚胎發(fā)育潛能評估中的作用仍有待進一步研究。

4 小 結

胚胎發(fā)育潛能評估仍是體外受精技術中的一個關鍵問題。形態(tài)學評分是目前應用最廣的評估方法，雖成熟、有效，但標準不統(tǒng)一，很難避免主觀性，且單一時間點觀察對著床結局的預測并不完全準確；囊胚培養(yǎng)進行胚胎再次篩選，單囊胚移植可較為有效地預防多胎妊娠，但仍不能避免將異常基因遺傳給子代。延時攝像技術提供了穩(wěn)定可控的實時胚胎觀察模式，PGT可從基因組學反映胚胎染色體及DNA狀態(tài)，其技術方法也正朝著無創(chuàng)檢測的方向發(fā)展。代謝組學檢測可提供胚胎細胞的生物功能狀況，展現(xiàn)出強大的潛在應用價值，為建立更準確的胚胎評估體系打下基礎。此類篩選方法從胚胎的形態(tài)、基因、代謝等多個層面入手，可更準確地評價胚胎發(fā)育潛能，但仍存在局限性，未來需更多大樣本數(shù)據(jù)支持。