生殖專科生物樣本庫建設探討

張倡銘，邊月紅，張 欣，曹永芝

(山東大學生殖醫學研究中心，山東 濟南 250012)

生物樣本庫是在知情同意前提下按照標準化程序采集、保存、使用各種人體的生命支持和代謝及其衍生物組分等信息，用于臨床疾病治療和實驗室研究的科學管理系統，也叫生物銀行[1]。生殖專科醫院擁有豐富的生殖相關疾病臨床資源，建立科學、規范、高效的專科生物樣本庫，能夠為生殖健康致病機制的研究和診療新靶點的發現奠定堅實基礎，從而為臨床基礎研究提供強力支撐。本文主要介紹了生殖專科樣本庫的建設經驗。

1 生殖專科樣本庫建設概述

1.1建立質量控制體系

1.1.1建立規范的質量控制文件 樣本庫需要按照中國人類遺傳資源辦公室“人類遺傳資源采集、收集、買賣、出口、出境審批”的要求申請該項認證。該認證對于加強人類遺傳資源的規范化管理，有效保護和合理利用人類遺傳資源提供了法律依據。按照ISO20387生物樣本庫國際標準和中國醫藥生物技術協會標準化達標文件要求，建立符合本單位的質量控制文件，涵蓋質量手冊、程序性文件、標準操作程序和原始記錄[2]，涉及出入庫、運輸、分裝、質量控制、銷毀、安全、后勤、行政等方面[3-4]。

1.1.2完善組織構架，實現專人專崗管理 樣本庫應依托所在醫院的學術委員會、倫理委員會，并設立專門的管理委員會。樣本收集和使用前召開學術論證會，在符合國家法律要求和倫理學規范的前提下，有針對性地收集和使用樣本。樣本庫設置固定工作人員，明確每位工作人員崗位職責，設置主任、樣本管理、質量管理、信息管理和辦公室等崗位，建立細化的工作量考核標準，樹立為科研人員服務的工作理念。

1.1.3合理設置功能分區，完善運行設施 樣本庫應分為樣本制備區、樣本質控區、低溫區、超低溫區和深低溫區等功能區，其中樣本接收區主要完成樣本接收后基本信息的采集和核對，樣本處理區主要完成對樣本的多級核對和各組分離，樣本制備區主要完成樣本的分裝、核酸提取等。超低溫區和深低溫區最好設置在1樓或加固承重的樓層，具有備用電源。配備自動化分裝、自動核酸提取和核酸質量檢測等設備。樣本庫設置獨立的門禁系統、視頻監控系統、遠程溫度監控報警系統和獨立通風裝置，確保樣本安全。

1.1.4加強運行權限與倫理管理 樣本出入庫應采用3級審批制度，根據不同管理級別設置不同權限。對樣本收集實行嚴格的倫理學審批，每份樣本附有《生物樣本采集知情同意書》，保證樣本的合法性，以發揮最大的科研價值[5]。

1.1.5做好信息化建設 樣本庫要在規范化、標準化和規模化上不斷提高，需要建立完備的收集、隨訪、儲存、信息化管理體系，實現臨床信息、樣本信息和科研信息的數字化管理。數據資源管理層主要由生物樣本資源數據庫、科研數據庫、臨床信息數據庫、隨訪數據庫和用戶數據庫組成，其功能包括但不限于：捐贈者身份信息和臨床信息采集、自主調查問卷設計、病例隨訪、管理硬件設備、耗材及生物樣本采集、處理、儲存和運輸等，并能夠從第三方系統[醫院信息系統(HIS)、檢驗信息系統(LIS)等]中產生相關的捐贈者數據庫。建議所有樣本采用二維碼標識和全過程跟蹤，根據工作需要持續升級信息化管理系統，并且與醫院的HIS、LIS系統對接，對樣本采集、樣本轉運、臨床診療、樣本檢驗、樣本制備存儲、樣本使用、隨訪和設備使用等信息進行全方面管理，并結合樣本使用者情況實現平臺信息共享和多中心信息共享[6]。研究生離校前將樣本相關科研信息全部留存樣本庫，逐步建立樣本科研信息知識庫，便于后續研究人員調閱和使用。

1.2樣本的收集與處理

1.2.1臨床資料信息管理 對臨床匯總信息、入庫信息、紙質臨床資料、知情同意書、樣本運輸信息、樣本出庫信息等進行權限化分級管理，避免秩序混亂、信息泄露和樣本信息使用不暢，提高樣本出入庫效率。知情同意書的內容和格式經過倫理小組制定并交由院倫理委員會審查，確保捐獻者知情權，并充分保護捐獻者隱私。

1.2.2血液樣本采集與處理 采用1支抗凝血和1支自凝血(采血管無添加劑)采集血液樣本，每支5 mL。抗凝血確保血液與抗凝劑充分混合，自凝血常溫放置15 min后處理，2 530 r/min離心10 min。利用自動化分裝設備提取血漿、血清、有核細胞層(有核細胞層分2管，血漿、血清為4管，每管0.5 mL)，將2管血漿和血清分別儲存于氣相液氮罐，其余儲存于-80 ℃冰箱。所有血液樣本采用分區備份儲存[7]。

1.2.3顆粒細胞、卵泡液樣本采集與處理 主要采集卵壁顆粒細胞樣本及其卵泡液。壁顆粒細胞處理：采集行輔助生殖取卵術后液體，2 000 r/min離心10 min，收集上清卵泡液，每管5 mL，分2管保存至-80 ℃冰箱。沉淀后加入1 mL透明質酸酶，輕輕震蕩，放入37 ℃水浴鍋30 min，然后轉移至15 mL離心管，加入3.5 mL淋巴細胞分離液。將水浴的混合物移入淋巴細胞分離液上層，1 600 r/min離心10 min。用一次性吸管將中層液面漂浮的顆粒細胞吸出，均分為2份，分裝至RNA-free凍存管，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，顛倒混勻，以8 000 r/min離心3 min，棄上清液，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4組織樣本的采集與處理 采集胎盤、臍帶、卵巢、子宮內膜、附睪穿刺物、蛻膜、絨毛等樣本，樣本取材完成后分別置于RNAlater、液氮、4%多聚甲醛中保存。為有效保證樣本質量，組織離體到有效保存所用時間不得超過30 min[8]。

1.2.5尿液樣本的采集與處理 所收取的尿液樣本有晨尿、隨機尿、計時尿(一般為24 h)、中段尿，尿量為15 mL。采集后使用帶底部二維碼的凍存管分裝，并根據信息系統分配的位置凍存于-80 ℃冰箱中。部分實驗室采取硝酸纖維膜真空抽濾的方式對尿液內細胞和蛋白成分進行膜上保存，具體操作如下：將尿液以3 600 r/min離心10 min，取上清液按照2∶1比例與PBS混勻,然后經0.2 μm的磷酸纖維膜真空抽濾后吹干，于無菌袋中抽真空保存[9]。

1.2.6核酸樣本的制備 基因組DNA提取的方法有很多種，如酚-氯仿法、異硫氰酸胍法、固相吸附法、高鹽沉淀法和碘化物法等[10]。RNA提取主要為Trizol法和磁珠法[11]。檢測RNA樣本濃度、純度和完整性，以二維碼標記后入庫。DNA樣本儲存于-80 ℃冰箱，RNA樣本保存于液氮中。在避免樣本反復凍融前提下，每半年進行1次核酸抽樣質檢，抽檢比例不低于1/100，并生成質控報告。

1.3樣本的質控 (1)血液樣本的質控：血液樣本以核酸質控為主，以OD260 nm/OD280 nm,OD260 nm/OD230 nm比值檢測核酸的純度，采用分光光度計定量檢測核酸的濃度，采用安捷倫4200檢測核酸的完整性。(2)組織樣本的質控：組織樣本在冷缺血30 min內迅速分裝和轉移至液氮中是保證樣本質量的必要條件，其可以有效地避免RNA及其蛋白質的降解。如后續實驗涉及RNA分析，應將離體組織迅速轉移到RNAlater中保存。樣本庫通過蘇木素-伊紅染色對組織樣本的形態學進行評估。提取RNA檢測其濃度、純度和完整性，并進行熒光定量分析。(3)尿液樣本的質控：目前，關于尿液樣本的質控報道較少見。多數樣本庫主要采取-80 ℃保存方法，但隨著保存時間的延長，尿液樣本的酸堿度、小分子物質會發生改變或消失。有研究報道，在-80、-20、4、20 ℃條件下保存的樣本經過0、4、8、24 h后，尿液樣本中不同種類的氨基酸(絲氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸)濃度會受到影響，其中-80 ℃保存效果最佳[12]。另外，反復凍融對尿液樣本代謝產物濃度會構成影響，因此在尿液樣本保存過程中，應盡量以-80 ℃保存，并減少反復凍融次數。(4)樣本信息質控：樣本庫每季度對所存樣本信息進行抽樣，對樣本所存位置是否準確、患者信息是否完整、隨訪信息是否完整、知情同意書是否完備、條碼是否完整、虛擬位置與實體位置是否一致等信息進行檢查。(5)樣本庫的第三方質控：生物樣本庫應積極開展國內、國際第三方質控，以保證樣本質量。

2 生殖專科樣本庫建設存在的問題及建議

2.1存在的問題 因患者回訪率高等因素，樣本數量持續增加，造成儲存空間不足。生物樣本庫建設中仍然需要從人才、資金、技術方面提供支持，需要政府和各參與方引起重視，保障其可持續發展[13]。生物樣本庫的發展需要標準化和規范化，其高度依賴信息化建設，離不開多中心聯盟和資源共享，需多學科融合支撐[14]。生殖樣本收集涉及科室較多，各收集環節銜接溝通需要樣本庫執行委員會統一協調。不設置婦產科的生殖專科醫院，樣本收取存在非本院本地等情況。因此，采集及運輸過程需要加強監管，保證取材、處理和運輸的質量，做到寧缺毋濫。

2.2建議

2.2.1科學的樣本質量控制是關鍵 影響樣本質量的因素非常多，而樣本質量直接關系到科研數據的準確性，因此加強生物樣本庫標準化建設顯得至關重要。近年來，國內和國際的樣本庫標準化組織不斷對樣本收集過程中的規范化和標準化進行完善[15]。目前，我國尚未建立國家層面的生物樣本庫，因此應更好地根據國情建立適應人民需要及適應經濟發展的生物樣本庫[16]。從事樣本庫建設的工作人員應該不斷學習，完善樣本收取流程，使樣本庫更科學、更貼近于臨床和科研需求。

2.2.2信息庫整合是樣本庫質量控制的紐帶 信息庫建設是保證生物樣本質量、信息注釋和樣本應用的紐帶。生物樣本庫發展已從“以樣本為中心”轉變為“以數據為中心”，最終形成綜合性生物信息資源平臺，這樣才能夠更好地為科學研究服務，便于研究人員探討生物樣本所涉及的醫學倫理、臨床溝通及社會問題[17]。未來生物樣本庫的內涵建設更需要聚焦于樣本本身的科學研究,即樣本科學[18]。通過大樣本的關聯分析，打造生命科學研究發展和國際合作的基礎平臺，實現樣本庫的質量管理、信息數據結構化與標準化數據共享，建立臨床信息、樣本信息、隨訪信息和科研信息相關聯的信息化系統平臺，為預測疾病的發生、發展與轉歸提供強力支撐。

3 小 結

生物樣本庫是為轉化醫學、藥物研發提供強力支持的新型學科。近年來，我國專科生物樣本庫發展迅速，但是仍然有許多瓶頸需要突破。完整、全流程的質量控制體系，可保證樣本質量。本文概述了生殖專科樣本庫建設過程，從生物樣本實體庫規范采集、儲存、質控和出庫等環節，以及臨床信息、樣本信息、科研信息和隨訪信息等要素的整合方面進行了討論，并探討了生殖專科樣本庫建設中存在的問題及應對策略，希望為該學科生物樣本庫的建設提供參考。