2020-2021年冬春季嬰幼兒急性胃腸炎病原學分析

崔偉波 徐張凱 王錦浩 陳程昊 周玉林 程東慶

急性胃腸炎是全球公共衛生問題之一，其臨床表現主要為腹瀉和嘔吐，影響各個年齡段人群，在兒童中尤為嚴重［1-2］。嬰幼兒腹瀉病因復雜，臨床常見相關病原主要為沙門菌、志賀菌、副溶血弧菌、致瀉性大腸埃希菌等細菌［3-4］，及輪狀病毒（rotavirus，RoV）、諾如病毒（norovirus，NoV），腸道腺病毒（adenovirus，AdV）和甲肝病毒（hepatitis A virus，HAV）等病毒［5］。病原性急性胃腸炎的傳播和暴發極大威脅社會公共衛生安全，影響社會穩定。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 選取2020至2021年冬春季臺州市仙居縣人民醫院5歲以下急性胃腸炎患兒糞便樣本78例，收集到的樣本部分做常規檢查，部分與醫用甘油1∶1混合后于-70℃保存備用。以2 h內直接留取樣本為準入原則，排除與尿不濕、紙巾及地面等接觸后留取的樣本；同時以靜脈采血法盡可能留取患者血常規樣本，1 h內完成檢測。

1.2 細菌病原學檢查 所有樣本開展沙門菌、志賀菌、副溶血弧菌、致瀉性大腸埃希菌及霍亂弧菌檢測，方法如下：取糞便樣本分區劃線接種于血平板、SS平板、4號平板等相應培養基，37℃下培養24 h，挑取可疑菌落接種于營養瓊脂斜面，37℃下培養24 h，取純培養物做革蘭染色和氧化酶等實驗，并采用VITEK2 Compact微生物鑒定儀（梅里埃股份有限公司）VITEK2，用GN卡鑒定病原菌。

1.3 病毒病原學檢查 （1）病毒核酸提取：取100 μL糞便樣本置于1.5 mL EP管，加入無菌磷酸鹽緩沖液稀釋成10%糞便懸液，旋渦振蕩2 min或樣本成均一狀態，將10%糞便懸液于3,000 rpm離心10 min，小心吸取200 μL上清液用于后續病毒核酸提取。病毒核酸提取按照柱式病毒抽提純化試劑盒說明書（上海生工生物）操作，病毒核酸提取后于-80℃保存，以備后續檢測。（2）急性胃腸炎病毒的檢測用多重PCR對樣本中RoV、NoV GI型、NoV GII型、AdV和HAV進行檢測，NoV GI型、NoV GII型、RoV和AdV引物、探針序列參考HAMZA等［6］人研究，HAV引物、探針序列參考COSTAFREDA等［7］人研究，引物和探針均由上海生工生物公司合成，見表1。反應體系和反應條件參考One Step PrimescriptTM RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司）說明書并做修改。反應體系如下：2×One Step RNA PCR buffer 12.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，反轉錄酶 0.5 μL，上下游引物各0.6 μL（20 μM），病毒探針各0.3 μL（20 μM），核酸模板5 μL，用無RNA酶水補總體積至25 μL。NoV GI型、NoV GII型和HAV反應條件：42℃逆轉錄30 min；95℃預變性5 min；95℃變性5 s，55℃退火延伸35 s，共40個循環。RoV和AdV反應條件：42℃逆轉錄30 min；95℃預變性2 min；95℃變性5 s，60℃退火延伸35 s，共40個循環。

表1 多重RT-qPCR檢測5種急性胃腸炎病毒引物探針序列

1.4 樣本常規檢查 （1）糞常規檢查：采集后的糞便樣本采用KF-F10糞便常規自動分析儀（珠海科域生物技術有限公司）進行檢測，所有操作均按照儀器說明書進行。（2）血常規及HS-CRP檢查：血常規樣本采用邁瑞BC5180血液分析儀進行血常規及HS-CRP聯合分析。所有操作均按照儀器說明書進行，質控品選擇原廠配發樣品。

1.5 病例分組情況 將患兒分為不同月齡組與糞便病毒學檢出情況進行比較分析；并根據病例細菌與病毒檢出情況分為病毒感染腹瀉組（n=24）與非細菌非病毒感染組（n=54）與糞常規中的隱血、鏡下白細胞檢出（＞3個/每視野）情況和血常規中的白細胞數、淋巴細胞百分比、HS-CRP值做差異性分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件。計量資料符合正態分布以（）表示，采用t檢驗；計數資料以［n（%）］表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腹瀉患者及樣本基本情況 共收集到78例符合標準糞便樣本，其中水樣便1例，糊狀便66例，軟便1例，稀便10例，主要以糊狀便為主。男患兒43例，女患兒35例，男女比為1.23/1。其中，患兒年齡最大為5歲，最小為1個月。

2.2 細菌學檢查結果 通過臨床細菌學檢查，未檢出沙門菌、志賀菌、副溶血弧菌、致瀉性大腸埃希菌及霍亂弧菌等腹瀉相關病原菌。

2.3 病毒學檢測結果 在78份大便樣本中檢出感染病毒樣本24例，總陽性率為30.77%。其中檢出AdV樣本13例，檢出率最高，為16.67%，24月齡以下病例占84.63%，在不同月齡段AdV檢出結果不存在統計學差異，見表2；其次檢出RoV樣本11例，檢出率為14.10%，24月齡以下病例占63.64%，在不同月齡段RoV檢出結果不存在統計學差異，見表2；NoV檢出率為6.41%，5例均為GII型，未檢出NoV GI型、HAV感染。同時檢出2種病毒樣本5例，其中1例為NoV GII型和RoV，3例為RoV和AdV，1例為NoV GII型和AdV。

表2 不同月齡組急性胃腸炎患兒糞便樣本病毒檢測結果（n）

2.4 糞便常規檢查結果分析 在78例樣本中共檢出糞便隱血陽性27例，陽性率為34.61%，高倍鏡（40×10）下檢出白細胞陽性（＞3個/每視野）28例，檢出率為35.90%，根據病原學檢測結果分為病毒感染腹瀉組和非細菌非病毒腹瀉組，比較兩組間糞便隱血實驗和白細胞鏡檢結果，發現病毒感染腹瀉組患兒鏡檢白細胞情況顯著低于非細菌非病毒腹瀉組患兒，且具有統計學差異（P＜0.05），隱血實驗未見統計學差異，見表3、表4。

表3 病毒感染腹瀉與非細菌非病毒腹瀉患兒隱血陽性率比較

表4 病毒感染腹瀉與非細菌非病毒腹瀉患兒糞便鏡檢白細胞情況比較

2.5 血常規檢查結果分析 78例患者中有40例進行血常規分析，根據病原學檢測結果分為病毒感染腹瀉組16例和非細菌非病毒腹瀉組24例，比較兩組之間白細胞計數、淋巴細胞百分比、HS-CRP水平，發現均不存在統計學差異（P均＞0.05），見表5。

表5 病毒感染腹瀉與非細菌非病毒腹瀉患兒血常規部分指標比較（）

表5 病毒感染腹瀉與非細菌非病毒腹瀉患兒血常規部分指標比較（）

組別 總例數 WBC（×109） LYN（%） HS-CRP（mg/L）病毒感染腹瀉組 16 10.73±3.97 34.88±16.40 20.61±27.00非細菌非病毒腹瀉組 24 11.47±4.38 32.08±19.21 10.47±13.50 t值 0.536 0.523 1.297 P值 0.595 0.604 0.202

3 討論

急性腹瀉被世界衛生組織認定為全球嬰幼兒死亡的第二大原因，而多數急性胃腸炎患者都會出現腹瀉的癥狀［1］。在本研究收集到的78例糞便樣本中，未檢出沙門菌、志賀菌、副溶血弧菌、致瀉性大腸埃希菌及霍亂弧菌等急性胃腸炎相關病原菌；其中共24例樣本檢出NoV GII、RoV、AdV等急性胃腸炎相關病毒，這表明在2020年至2021年冬春季，仙居縣醫院5歲以下嬰幼兒急性胃腸炎主要由病毒引起。

基于患兒糞便樣本急性胃腸炎病毒檢測結果，分為病毒感染腹瀉組和非細菌非病毒腹瀉組，比較分析患兒糞常規隱血實驗和白細胞鏡檢結果發現，病毒感染腹瀉組和非細菌非病毒腹瀉組鏡檢白細胞陽性率分別為5.13%和30.77%，在統計學上具有顯著差異（P＜0.05），糞便白細胞鏡檢對病毒性急性胃腸炎的診斷起到指導作用；病毒感染腹瀉組與非細菌非病毒腹瀉組隱血陽性率分別為10.26%和24.36%，無統計學差異。由此推斷病毒感染腹瀉所引起的腸道炎癥反應不明顯，而非細菌非病毒腹瀉具有較大的胃腸道炎癥反應。

白細胞和HS-CRP一直是臨床上重要的炎癥指標，但在本研究中兩組數據均無統計學差異。就淋巴細胞百分比而言，可能與嬰幼兒患者個體因素相關，嬰幼兒時期淋巴細胞百分比本身相對較高，或因腹瀉引起脫水無法及時調節，使非細菌非病毒腹瀉組患兒淋巴細胞百分比升高；而HS-CRP就數值而言，兩者存在不小差異，但在統計學分析上無顯著差異，可能與整體的樣本數量偏少有關，有待收集更多樣本進行分析。

在78例糞便樣本中，24例樣本至少檢出一種病毒，總陽性率為30.77%，與彭華等［8］報道的病毒性腹瀉監測的陽性率32.29%較為接近。在本次研究中，RoV、NoV和AdV是引起嬰幼兒病毒性腹瀉的主要病原體，與邵偉芳等［9］研究結果相近。在本次研究，不同年齡段之間病毒的檢出率沒有顯著差異，這可能與本研究中收集到樣本數較少有關。不過，檢出病毒陽性的患者主要分布主要集中在6~24月齡之間，與任海燕等［10］、吳坤等［11］研究結果相近。這可能也是急性胃腸炎在發展中國家能夠引起重大醫療壓力和疾病負擔的原因之一。相對于上述三種病毒，NoV GI型和HAV感染人群中發病率較低［12-13］，在本次研究中也未檢出NoV GI型和HAV的感染。

在我國病毒性急性胃腸炎的防控形勢較為復雜，NoV、RoV、AdV等常見的胃腸炎病毒不斷有零散病例發生乃至暴發疫情，扎如病毒、星狀病毒等病毒也逐漸流行起來?；诖?，我國應進一步加強病原性急性胃腸炎監測網絡平臺的構建，更好監測病原性急性胃腸炎的流行情況，為疫苗研發等預防控制措施提供有效的數據支持。