內翻畸形膝關節骨關節炎患者關節液對軟骨細胞的影響

王屹侃 李鐘陳 金建強

膝關節骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見的慢性退行性疾病，以疼痛、關節活動功能障礙為主要特征［1-2］。KOA發生后，軟骨磨損，關節間隙變窄，可出現畸形，其中內翻畸形是膝關節常見的畸形表現［3］。內、外側間室關節軟骨處于相同內環境，在炎性關節液中長期暴露，但由于內翻畸形，應力集中于內側間室。因此，臨床上常見內側間室關節軟骨嚴重退變，而外側間室軟骨仍然良好［4］。目前國內外關于間室軟骨退變分子生物學水平初步評價的報道尚少。因此，本研究初步探討內翻畸形有、無外側間室關節軟骨病變的KOA患者關節液對軟骨細胞增殖、凋亡及自噬的影響，以期為臨床預防和干預KOA提供指導依據。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12只普通級新西蘭大白兔，4周齡，體質量為0.42~0.45 kg，購于浙江中醫藥大學實驗動物研究中心，飼養于中心屏障系統內，動物許可證號：［SYXK（浙）2013-0184］。本研究所涉及的動物操作獲得浙江中醫藥大學動物中心倫理委員會的批準（倫理編號：ZSLL-2019-124）。

1.2 儀器及試劑 白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）ELISA試劑盒購于酶免公司；GAPDH抗體（批號：60004-1-1g）購于華安生物；甲苯胺藍試劑盒（批號：G3668）購于索萊寶；細胞增殖核抗原（PCNA）、Bcl-2、Bax、LC3B、P62、Beclin-1、BMP2、mTOR抗體購于Abcam公司；PI3K、AKT（批號：AF6242、AF6261）購于Affinity公司。AE2000倒置顯微鏡（Motic）， C6流式細胞儀（BD）。

1.3 軟骨細胞的分離與培養 無菌切取新西蘭大白兔關節軟骨，解剖刀剪成碎塊（1 mm×1 mm×1 mm），經透明質酸酶、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原依次消化，加入含10% FBS的DMEM：F12（1∶1）培養液制成單細胞懸液，傳代培養，以甲苯胺藍染色進行軟骨細胞鑒定。

1.4 膝關節關節液標本的收集與分組 按照中華醫學會骨科學分會制定的《骨關節炎診治指南（2018年版）》［5］，選取本院2019年5月至8月經影像學確診為內翻畸形伴有外側間室關節軟骨病變的KOA患者7例及內翻畸形無外側間室關節軟骨病變的KOA患者10例。常規消毒，鋪單，沿髕骨下緣入路行膝關節穿刺，抽取5 mL關節液原液。關節液置于EP管，以3,000 r/min的速度在4 ℃下離心30 min，取上清液，經0.45 μm和0.22 μm微孔濾過膜過濾，置于4℃冰箱保存備用。內翻畸形伴有外側間室關節軟骨病變的KOA關節液設為觀察組，內翻畸形無外側間室關節軟骨病變的KOA關節液設為對照組。

1.5 關節液炎癥因子生化分析 參照相關試劑盒說明，采用ELISA法檢測觀察組及對照組關節液中IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13的含量水平。

1.6 CCK-8法檢測軟骨細胞生長情況 取P1代軟骨細胞，接種于96孔板，3×103/孔，分3組各設6個復孔平行對照，培養12 h，棄去培養基。使用10%內翻畸形伴有外側間室關節軟骨病變的KOA關節液+10%FBS的DMEM：F12（1∶1）培養液設為實驗組，使用10%內翻畸形無外側間室關節軟骨病變的KOA關節液+10% FBS的DMEM：F12（1∶1）培養液設為陰性對照組，2 d/次進行換液；使用只含10% FBS的DMEM：F12（1∶1）培養液設為空白組。各組分別于0、1、2、3 d避光條件下加入CCK-8試劑，3 h后，采用酶標儀在450 nm波長下檢測吸光度（OD）值，用以分析細胞增殖能力。

1.7 流式細胞術檢測軟骨細胞凋亡 于6孔板接種對數生長期軟骨細胞，細胞貼壁后，使用培養液，按上述分組，處理24 h后，胰酶消化，離心棄上清液，預冷PBS洗滌，調整細胞濃度至1×106個/mL，5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，上機前5 min，加入5 μL PI染色。采用流式細胞儀檢測軟骨細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.8 免疫熒光法檢測軟骨細胞LC3B及P62蛋白表達 選取第3代軟骨細胞爬片，細胞貼壁后按上述分組處理后，加預冷4% PFA固定，PBS漂洗；加0.5%Triton X-100通透細胞膜，加3% BSA封閉液封閉，加一抗（LC3B，P62），孵育，PBS漂洗，加二抗，室溫下避光孵育0.5 h，PBS漂洗，加DAPI對細胞核進行染色，抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.9 Western blot法檢測軟骨細胞自噬及凋亡相關蛋白的表達 軟骨細胞以RIPA裂解液冰上裂解30 min后，BCA法測定蛋白濃度，5% SDS-PAGE濃縮膠電泳分離蛋白，轉PVDF膜。封閉液封閉，TBST洗膜3次，加入含一抗，4 ℃振蕩過夜孵育，加入相應二抗，室溫孵育1~2 h，TBST洗膜3次。以GAPDH為內參，ECL化學發光試劑盒處理，Chemi capture軟件拍攝處理圖像。

1.10 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料多組間用One-way-ANOAY單因素方差分析，組間比較采用SNK分析。方差不齊者采用Kruskal-Wallis H檢驗。所有數據以均值（）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組關節液IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13含量水平比較 采用ELISA法測定兩組關節液中IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13的含量水平，觀察組關節液IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13水平顯著高于對照組（P＜0.01）。見表 1。

表1 兩組關節液IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13含量水平比較［pg/mL，（）］

表1 兩組關節液IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13含量水平比較［pg/mL，（）］

注：與觀察組相比，*P＜0.05

組別 n IL-1β TNF-α IL-6 MMP-13觀察組 7 64.65±10.32 106.48±8.15 76.54±14.6 230.57±61.14對照組 10 41.05±5.64* 65.36±7.65* 51.26±4.68* 176.72±53.16*

2.2 軟骨細胞形態觀察 軟骨細胞分離培養第5天時正常貼壁生長，光鏡下觀察可知細胞呈多邊形，經甲苯胺藍染色鑒定細胞為軟骨細胞來源。見圖1。

圖1 軟骨細胞形態觀察（×400）

2.3 CCK-8法檢測軟骨細胞增殖 與空白組相比，第1天細胞活力無顯著差異（P＞0.05），第2、3天實驗組OD值顯著降低（P＜0.01），生長減緩，而陰性對照組較空白組無顯著差異（P＞0.05）。見圖2。

圖2 CCK-8法檢測共培養軟骨細胞增殖

2.4 流式細胞術檢測軟骨細胞凋亡與空白組相比，實驗組軟骨細胞的凋亡率顯著升高（P＜0.01），而陰性對照組軟骨細胞凋亡率無顯著變化（P＞0.05）。與陰性對照組相比，實驗組軟骨細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 共培養軟骨細胞凋亡率比較

2.5 免疫熒光法檢測軟骨細胞LC3B、P62蛋白表達 與空白組比較，實驗組軟骨細胞LC3B熒光強度顯著加強（P＜0.01），P62 熒光強度顯著減弱（P＜0.01），陰性對照組LC3B和P62熒光強度差異不顯著（P＞0.05）；且實驗組與陰性對照組間LC3B、P62熒光強度有顯著差異（P＜0.01）。見圖 4。

圖4 共培養軟骨細胞LC3B和P62蛋白表達水平比較

2.6 Western blot法檢測軟骨細胞自噬相關蛋白的表達 與空白組相比，實驗組與陰性對照組軟骨細胞中PCNA、Bcl-2、P62與BMP-2的蛋白表達水平均顯著降 低（P＜0.05）；Bax、LC3、Beclin-1、PI3K、AKT 與mTOR的蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與陰性對照組相比，實驗組軟骨細胞中PCNA、Bcl-2、P62、BMP-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；Bax、LC3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 共培養軟骨細胞PCNA、Bcl-2、Bax、LC3Ⅱ、P62、Beclin-1、BMP-2、PI3K、AKT與mTOR蛋白表達水平

3 討論

KOA是一種以關節軟骨細胞受到損傷，膠原降解丟失，形成骨贅等為主要病理特征的慢性退行性疾病［6］。臨床上，內翻畸形內、外側間室關節軟骨退變程度差異顯著，但相關分子生物學研究報道較少。研究表明，IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性介質在OA進展中具有重要作用［7］。TNF-α及IL-1β可干擾軟骨細胞正常代謝，參與軟骨吸收，進而破壞軟骨關節［8］。本研究通過分別收集內翻畸形有、無外側間室關節軟骨病變KOA患者的關節液，發現觀察組的IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13水平較陰性對照組顯著升高，推測炎性因子水平升高可能促進KOA病變。研究表明，軟骨細胞數量的減少與KOA的進展密切相關［9］。本研究中，內翻畸形伴有外側間室關節軟骨病變的KOA患者關節液抑制新西蘭兔軟骨細胞生長活力，具有抑制軟骨細胞增殖的作用。此外，伴有外側間室關節軟骨病變的KOA患者關節液較無外側間室關節軟骨病變的患者關節液更易誘導軟骨細胞凋亡。

PCNA可反映細胞增殖活動，Bax傳遞凋亡信號，為促凋亡蛋白，Bcl-2可與Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號，為抗凋亡蛋白［10］。本研究中，兩組KOA關節液均可顯著下調PCNA、Bcl-2、BMP-2蛋白表達水平，上調Bax蛋白表達，且實驗組作用更顯著，提示內翻畸形KOA關節液具有抑制軟骨細胞增殖的作用。

自噬是一種分解代謝過程，可通過吞噬和降解受損的細胞器和蛋白質來維持能量水平和更新細胞器，維持細胞內環境穩定。研究發現，其參與的關節軟骨退化過程及軟骨細胞自噬缺陷與KOA的發生密切相關［11］。KOA病變初期，自噬相關蛋白LC3與自噬調節物Beclin-1在軟骨細胞中表達增加，自噬增強，可保護軟骨細胞；而KOA中后期，代償能力不足，自噬則被抑制，致細胞損傷［12］。此外，PI3K/AKT信號傳導，可調控mTOR參與自噬［13］。本研究中，KOA關節液可下調軟骨細胞中P62蛋白表達水平，上調LC3 、Beclin-1、PI3K、AKT與mTOR蛋白表達，提示內翻畸形KOA關節液可激活軟骨細胞自噬機制，且伴有外側間室關節軟骨病變的KOA關節液增強細胞自噬的作用尤為顯著。

綜上所述，內翻畸形的KOA關節液具有抑制體外軟骨細胞增殖，誘導細胞凋亡，激活軟骨細胞自噬的作用，這可能是促進KOA進程的作用機制之一。然而，軟骨細胞深層的潛在作用機制仍有待進一步研究。