嗜堿性粒細胞活化試驗的臨床應用

高亞東，張珒珒，劉光輝

武漢大學中南醫院過敏反應科（武漢 430071）

近年來，過敏性疾病的發病率不斷上升[1]。過敏原檢測是診斷過敏性疾病的重要手段，目前常用的方法包括體內和體外檢測兩大類。體內檢測包括皮內試驗、皮膚點刺試驗（skin prick testing，SPT）、斑貼試驗和過敏原激發試驗；體外檢測包括血清中過敏原特異性免疫球蛋白E（specific Immunoglobulin E，sIgE）檢測和嗜堿性粒細胞活化試驗（basophil activation test，BAT）。皮膚試驗操作簡便、快捷，但易受藥物和皮膚狀況的影響，出現假陰性和假陽性結果；過敏原sIgE檢測雖受藥物影響小，但可檢測范圍小，難以對藥物和食物過敏進行檢測; 過敏原激發試驗是診斷過敏性疾病的金標準，但存在發生嚴重過敏反應的風險[2]。BAT可在體外模擬速發型過敏反應過程，對于診斷過敏性疾病以及評估過敏原特異性免疫治療（allergen specific immunotherapy，AIT）的療效具有較好的應用價值。BAT 可部分替代SPT和過敏原激發試驗，從而減少不良反應的發生[3]。隨著技術的進步及過敏性疾病發病率的升高，BAT的臨床應用趨于普及。本文就BAT的基本原理、評價指標及臨床應用作一綜述。

1 嗜堿性粒細胞在過敏反應中的作用

嗜堿性粒細胞屬于造血系統細胞，在骨髓發育成熟后進入血液循環[4]，其在外周組織分布較少，只在發生炎癥反應時才進入外周組織[5]。嗜堿性粒細胞表面表達高親和力IgE受體（the highaffinity IgE receptor，FcεRⅠ），受抗原等刺激后，釋放一系列炎癥介質，如組胺、半胱氨酸白三烯、前列腺素D2、白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-13、IL-6、胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）和B細胞活化因子等，參與IgE介導的過敏反應，如食物過敏、藥物過敏、昆蟲叮咬過敏和嚴重過敏反應等[5-6]。

嗜堿性粒細胞參與了2型炎癥反應過程[7]。對于過敏性鼻炎和過敏性哮喘，受塵螨等抗原刺激后，氣道上皮細胞分泌TSLP[8]，促進嗜堿性粒細胞分泌IL-4[9]，IL-4通過促進輔助性T細胞2（T helper 2 cell，Th2）或2型天然淋巴細胞（type 2 innate lymphoid cells，ILC2）分化，導致2型炎癥反應[10]。嗜堿性粒細胞也參與了特應性皮炎的發生[11]。此外，TSLP誘導嗜堿性粒細胞釋放IL-4，促進食物過敏原的經表皮致敏[12]。嗜堿性粒細胞還可通過胞啃機制，從樹突狀細胞獲得主要組織相容性復合體Ⅱ分子，獲得抗原遞呈功能，并參與Th2型反應[7]。

2 嗜堿性粒細胞活化試驗

2.1 概述

BAT是一種體外過敏反應檢測方法，可在體外模擬體內I型超敏反應過程，用于過敏原的體外檢測和AIT的療效評估。其利用流式細胞術檢測嗜堿性粒細胞表面活化標志物的表達。當抗原或抗IgE抗體誘導IgE受體FcεRI交聯后，這些活化標志物的表達將上調[13]。通常采用外周靜脈全血或分離的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）進行 BAT。PBMCs分離需密度梯度離心等程序，可能造成細胞丟失和背景活化，影響結果判斷。全血更接近嗜堿性粒細胞的體內環境，更符合生理狀態。全血BAT 應在采血后4 h內進行，以保持嗜堿性粒細胞最大活性和功能。隨著離體時間增加，嗜堿性粒細胞活性下降[14]。

2.2 BAT過敏原和刺激液的選擇

應根據患者的病史選用最可能的過敏原進行BAT。SPT和（或）血清過敏原sIgE的檢測結果可為過敏原的選擇提供參考[4]。過敏原可采用粗提物、純化或重組的單一組分，相較粗提物，重組過敏原具有更好的穩定性和一致性[4]。為便于不同實驗室之間數據比較，建議采用標準化過敏原。試驗需記載過敏原的來源、濃度及濃度單位、生產批號及生產廠家[4]。對于過敏原粗提物，應采用標準化的提取方法，并在不同濃度下測試嗜堿性粒細胞的反應性，如嗜堿性粒細胞被激活，則應使用該過敏原在1～3名健康個體中測試其特異性，排除假陽性[4]。

5%～10%的過敏患者在抗原或抗IgE刺激后，嗜堿性粒細胞不會出現組胺釋放反應，但對非特異性刺激如趨化肽N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP）仍存在反應，這類患者被稱為無反應者[15]，其發生機制可能與細胞內信號傳導途徑缺陷有關[16]，但這些BAT或組胺釋放試驗無反應者仍可能出現過敏癥狀和SPT陽性（由肥大細胞介導）[4]。因此，BAT的陽性對照應包括IgE依賴（如抗FcεRI或抗IgE抗體）和非IgE依賴的刺激（如fMLP）[4]，陰性對照只包含刺激緩沖液，以評價背景活化水平，如使用IL-3進行預刺激，則需另增加一組含有IL-3的陰性對照[4,17]。

2.3 嗜堿性粒細胞活化標志物

進行BAT時，需特異性表面標志物來鑒定嗜堿性粒細胞，常用鑒定標志物包括CCR3+、CD123+/HLADR-、CRTH2+和 CD193+等[4]。隨著研究的深入，越來越多的表面活化標志物被發現，包括 CD11b、CD13、CD63、CD69、CD107a、CD164、CD203c和 CD300c[4,18-21]，其中 CD63、CD203c和CD69應用最為廣泛，相關試劑盒已用于臨床檢測。根據表面標志物活化的生物學機制可分為三類：①顆粒膜成分，脫顆粒時與細胞膜融合，從而表達在細胞表面，如CD63和CD107；②快速釋放型囊泡，對IL-3等刺激產生反應，但不一定有介質釋放，如CD13、CD11b、CD164和CD203c；③新合成蛋白，需數小時完成轉錄、翻譯和轉運過程，包括ST2和CD69[22]。可根據研究目的選擇不同活化標志物或綜合判斷BAT結果。總體上，目前發現的活化標志物表達對BAT特異性較高，但敏感性相對較低，因此需進一步尋找較為敏感的其他表面標志物或表面標志物的組合，以提高BAT的敏感性和特異性。

2.4 BAT結果表達和解讀

BAT檢測嗜堿性粒細胞表面活化標志物的表達水平，即CD63+和（或）CD203c+嗜堿性粒細胞的百分比，可采用反應性和敏感性兩種指標表示。反應性可用某一抗原濃度刺激下CD63+嗜堿性粒細胞的百分比表示，也可用出現最大比例嗜堿性粒細胞活化時的抗原濃度（CD-max）表示；敏感性可用能引起50%最大比例嗜堿性粒細胞活化時的抗原濃度（EC50）表示，也可用嗜堿性粒細胞過敏原閾值敏感性（basophil allergen threshold sensitivity，CD-sens）表示，計算公式為CD-sens=1/EC50×100[4,22]。反應性與嗜堿性粒細胞的預激狀態以及IgE信號的細胞內傳導有關，而敏感性是反應性的函數，與細胞表面過敏原sIgE、過敏原的親和力、血液中游離的競爭性免疫球蛋白親和力有關。檢測反應性時需設置陽性對照，過敏原的陽性反應也需在臨床背景下進行解讀[4]。

敏感性檢測前通常先確定嗜堿性粒細胞的反應性。根據6～8個濃度梯度過敏原的反應性進行劑量-效應曲線擬合，分別計算EC50和CD-sens[4,17]。也可用劑量-效應曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）反映細胞活化狀態[4]。當嗜堿性粒細胞活化狀態下降時，劑量-效應曲線右移，其反應性可以不變，但敏感性下降，同時AUC下降[22]。綜合利用這些指標有助于BAT結果的分析和評價。

3 嗜堿性粒細胞活化試驗的臨床應用

3.1 食物過敏

食物過敏發生率不斷增加，兒童尤為明顯[23]，根據其發生機制，大致可分為IgE介導和非IgE介導兩類[23-24]。食物過敏常用的診斷方法包括SPT、食物sIgE檢測以及口服食物激發試驗（oral food challenge，OFC)。前兩種方法敏感性高，但特異性較低，雙盲安慰劑對照OFC是診斷食物過敏的金標準，但操作復雜，有發生嚴重過敏反應的風險[24-25]。BAT對食物過敏診斷的準確性較高，且能夠區分單純食物致敏（食物sIgE升高但無癥狀）還是食物過敏[26]。有研究顯示BAT診斷花生過敏的特異性達100%[26]，另有研究顯示BAT對花生過敏原組分如Ara h 2和Ara h 6具有較高的診斷準確性[27]。此外，嗜堿性粒細胞的活化率也可反映食物過敏的嚴重程度[28]。BAT還可用于檢測食物過敏的進程。對接受口服免疫治療（oral immunotherapy，OIT）的花生過敏患者進行定期BAT檢測，發現停止治療后對花生過敏原呈現持續無反應者，Ara h 2抗原誘導的BAT活性在脫敏治療早期明顯下降；相反，對花生過敏原短暫耐受者的BAT敏感性在OIT治療的早期和晚期均無變化，且嗜堿性粒細胞的AUC出現反彈，提示BAT可用于花生過敏者OIT療效的預測和評估[29]。

3.2 藥物過敏

藥物引起的過敏反應較為復雜，包括I型超敏反應和其他類型的超敏反應[30]。由于藥物的半抗原特性，常與其他蛋白結合引起過敏反應，因此表位難以確定，臨床上同時應用幾種藥物時體內的免疫反應特點和臨床表現變化較大[31]。藥物激發試驗是診斷藥物過敏反應的金標準，但耗時長，且存在發生嚴重過敏反應的風險，限制了其應用[32]，因此BAT等體外診斷方法在藥物過敏反應診斷和評價中的應用逐漸增多[15]。目前BAT已用于神經肌肉阻斷劑、β-內酰胺類抗生素、非甾體類抗炎藥、放射造影劑、洗必泰、明膠和羥甲基纖維素等過敏的診斷[33]。研究顯示BAT對抗生素過敏的診斷特異性達92%，對非甾體類抗炎藥過敏的診斷特異性達100%[34]。另有研究顯示，BAT可減少對阿莫西林克拉維酸鉀過敏患者進行不必要的藥物激發試驗[35]。此外，BAT也可輔助判斷鉑類化療藥物過敏患者快速脫敏時發生嚴重過敏反應的情況，若CD63+和CD203c+嗜堿性粒細胞比例高，則提示較高的嚴重過敏反應發生風險[36]。藥物過敏BAT的臨床應用尚有以下關鍵問題待探索：①最佳藥物濃度；②BAT陽性閾值；③試驗所需最少嗜堿性粒細胞數量；④藥物可溶性；⑤血液樣本的制備（全血或分離的PBMCs）；⑥最佳處理條件（如IL-3預刺激、預溫、孵育時間等）[33]。對藥物過敏患者進行詳細的病史采集同時結合BAT檢測結果，可減少開展藥物激發試驗及其發生風險[33]。除常規BAT外，也可進行被動致敏BAT來輔助診斷藥物過敏[33]。

3.3 氣道過敏性疾病

3.3.1 過敏性鼻炎

BAT在過敏性鼻炎中的應用尚存爭議。一項研究比較了塵螨和艾蒿過敏性鼻炎患者AIT治療前與治療24個月后嗜堿性粒細胞反應性的變化情況，發現塵螨抗原的嗜堿性粒細胞反應性前后無變化，艾蒿抗原的嗜堿性粒細胞反應性則顯著下降，但兩種過敏原的嗜堿性粒細胞反應性變化與過敏性鼻炎的臨床癥狀改善之間無相關性[37]。血清sIgE和SPT難以準確診斷局部過敏性鼻炎[38]，對于這類患者，盡管外周血中總IgE水平并無升高，但采用BAT仍可鑒定IgE介導的過敏反應，且敏感性較高。嗜堿性粒細胞的敏感性與鼻激發試驗的抗原滴度和支氣管激發試驗的陽性閾值呈正相關，但BAT能否代替鼻激發試驗診斷局部過敏性鼻炎仍存爭議[39]。目前研究多用嗜堿性粒細胞反應性作為評價指標，但其敏感性和特異性較低，需采用CD-sens或多種活化指標進行綜合判斷。

3.3.2 過敏性哮喘

常用CD-sens對過敏性哮喘患者的BAT檢測結果進行評價。CD-sens越高，表示對過敏原的敏感性越高[40]。CD-sens與過敏原支氣管激發試驗時第1秒用力呼氣容積下降20%激發劑量呈相關性，提示可用CD-sens代替支氣管激發試驗評價患者對過敏原的敏感性[41]。兒童重度哮喘患者中有明顯癥狀者的CD-sens顯著高于控制良好者，而CD-sens與哮喘控制測試（asthma control test，ACT）評分和呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）水平呈顯著負相關，提示CD-sens可輔助評價哮喘患者的病情嚴重程度[42]。對于接受抗IgE單克隆抗體治療的過敏性鼻炎和（或）哮喘患者，CD-sens對于療效評價的敏感性高于反應性[43]。

3.4 膜翅目昆蟲毒液過敏

膜翅目昆蟲叮咬可引起局部或全身過敏反應，嚴重時可導致過敏性休克[44]。一項研究對蜜蜂、黃蜂和大黃蜂蜂毒過敏者分別進行SPT、血清sIgE和BAT檢測，結果顯示BAT的診斷敏感性接近sIgE檢測，但特異性明顯高于sIgE檢測，提示BAT對該類過敏患者診斷的陽性預測值較高[45]。對于昆蟲毒液脫敏治療（venom immunotherapy，VIT）患者，常規毒液SPT和sIgE檢測的臨床價值不大，有研究顯示在接受VIT 5年后，50%患者的sIgE檢測結果仍呈陽性，而SPT結果亦無顯著變化[46]。相對而言，BAT 對VIT患者的療效評價具有更大價值。VIT治療后耐受者BAT 敏感性顯著低于VIT治療后未耐受和未接受VIT治療的蜂毒液過敏者[47]。對VIT 患者進行長期觀察發現，以CD63為標志物的BAT結果呈動態變化，即在治療早期（1～3個月），嗜堿性粒細胞對毒液抗原刺激的反應性下降，但3個月后出現上升，直到18個月后再次下降至較低水平或呈陰性并持續至治療結束，提示臨床應用BAT評價VIT療效時要充分考慮患者的治療時長及個體差異[48]。

3.5 嚴重過敏反應

研究發現在發生嚴重過敏反應時，嗜堿性粒細胞水平下降，同時伴有趨化因子CCL2水平升高，提示在嚴重過敏反應期間，嗜堿性粒細胞遷移至外周并參與了嚴重過敏反應過程[49]。有嚴重過敏反應史的患者，體內試驗如過敏原皮試引起不良反應的風險增加。因此，sIgE和BAT等體外試驗是相對安全的診斷方法。食物過敏、膜翅目昆蟲毒液過敏和藥物過敏所致嚴重過敏反應都可以采用相應抗原進行BAT來輔助診斷，以降低皮試相關不良反應風險，并評估患者脫敏治療后的療效。一項研究測試了嚴重過敏反應患者發作時的嗜堿性粒細胞活化水平，發現大部分患者的嗜堿性粒細胞CD203c表達水平無上升，經抗IgE抗體刺激后其水平也未明顯上升，提示這些細胞可能已經充分活化或多為不成熟嗜堿性粒細胞[50]。

3.6 過敏性輸血反應

BAT也可用于過敏性輸血反應（allergic transfusion reactions，ATR）的診斷。ATR是輸注血漿和濃縮血小板時最常見的輸血反應[51]，目前認為主要由肥大細胞和嗜堿性粒細胞介導[52]。血漿類胰蛋白酶水平雖然可以用于ATR的診斷，但無法鑒別因果關系，因此應用價值有限[53]。對輸注甲基藍處理的血漿后出現過敏反應的患者血液和殘留血漿進行BAT時，所有患者均出現了由甲基藍誘導、IgE 介導的嚴重過敏反應[51]。同樣，引起ATR 的殘留血漿上清液也可激活健康人嗜堿性粒細胞和ATR 患者自身的嗜堿性粒細胞，提示ATR 與輸血有關[51]。有研究發現，某些供血者存在抗IgE的IgG抗體，其血清會導致受血者出現嚴重過敏反應, 而BAT可能有助于鑒別此類供血者，從而減少ATR的發生[54]。血液腫瘤、再生障礙性貧血或實體腫瘤治療后骨髓抑制患者，由于體內的嗜堿性粒細胞數量極低或缺乏，無法進行BAT，對該類患者可進行被動致敏BAT來輔助診斷ATR[55]。其方法與前述藥物過敏者的被動致敏BAT類似，以殘留的輸血制品作為過敏原以刺激嗜堿性粒細胞的活化。結果顯示，導致過敏的濃縮血小板上清液能夠活化患者IgE致敏的嗜堿性粒細胞，而無法活化正常個體IgE致敏的嗜堿性粒細胞，提示被動致敏BAT用于ATR的診斷具有較高的特異性[55-56]。

3.7 過敏原特異性免疫治療的療效評價和預測

如前所述，利用BAT檢測嗜堿性粒細胞對過敏原的敏感性是評價AIT療效的有效手段。CD-sens在AIT早期即可出現下降，且與血清IgG4 水平相關，但嗜堿性粒細胞反應性無變化，提示CD-sens是AIT療效評價的敏感指標，優于嗜堿性粒細胞反應性[4]。CD-sens 在多種氣傳過敏原（如樺樹花粉、梯牧草花粉等）AIT治療后都可出現下降，也可用于食物過敏OIT和昆蟲毒液VIT治療的療效評價和預測[46]。VIT治療后早期出現的嗜堿性粒細胞活性抑制可能與誘導嗜堿性粒細胞表達抑制性組胺H2受體相關[57]。有研究報道嗜堿性粒細胞表達的二胺氧化酶也可以作為AIT反應的生物標志物[58-59]。

4 結語

BAT作為IgE介導的過敏原體外診斷方法之一，在過敏性疾病的診斷和AIT療效評價中具有重要應用價值，但尚需對試驗所需的過敏原（抗原）、操作過程和結果解讀進行標準化，以便于該方法的推廣和完善。