丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復(fù)蘇對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的作用

張瓊月，張婧婧，蔣琳琳，吳唐靜，張宗澤，王焱林

武漢大學(xué)中南醫(yī)院麻醉科（武漢 430071）

失血性休克是臨床常見的死亡原因之一[1]。失血性休克后，需在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行復(fù)蘇，但復(fù)蘇早期的再灌注損傷易導(dǎo)致患者出現(xiàn)多器官損傷[2]，如腎臟對(duì)缺血再灌注十分敏感，容易發(fā)生損傷，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)腎功能衰竭[3]。研究顯示，靜脈復(fù)蘇對(duì)失血性休克伴發(fā)的腎臟損傷的治療效果并不理想，同時(shí)，大量快速液體復(fù)蘇可造成腎臟進(jìn)一步損傷，因此，減輕因休克復(fù)蘇后再灌注產(chǎn)生的腎損傷十分關(guān)鍵[4-6]。炎癥損傷是造成器官再灌注損傷的主要原因[7-8]。組織器官發(fā)生再灌注損傷取決于組織器官內(nèi)炎性反應(yīng)的程度與性質(zhì)，與炎癥反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子主要有腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素等[9]。JAK/STAT 通路廣泛參與細(xì)胞應(yīng)激、生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等。TNF-α、IL-1β等多種細(xì)胞因子都是通過活化JAK/STAT 通路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10-11]。研究表明，JAK2/STAT3 信號(hào)通路參與了腎缺血再灌注損傷過程[12]。丙酮酸是機(jī)體代謝的重要中間產(chǎn)物和三羧酸循環(huán)底物。研究顯示丙酮酸鹽可以減輕失血性休克動(dòng)物由于復(fù)蘇所致的器官缺血再灌注損傷[13]。本團(tuán)隊(duì)前期研究中還發(fā)現(xiàn)，丙酮酸鹽腹腔復(fù)蘇能夠抑制失血性休克大鼠腸組織JAK2/STAT3信號(hào)通路，改善腸缺血再灌注損傷。據(jù)此，本研究擬探討丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復(fù)蘇對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供健康成年雄性SPF級(jí)SD大鼠40只，體重為200～250 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、靜脈復(fù)蘇組（VR組）、生理鹽水腹腔復(fù)蘇組（NR組）和丙酮酸鹽腹腔復(fù)蘇組（PR組） 4組，每組10只。本實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)（WP2020-08138）。

1.2 主要試劑

2.5%葡萄糖丙酮酸鹽腹膜透析液（P-PDS）：丙酮酸根離子40 mmol/L、Na+132 mmol/L、Ca2+1.75 mmol/L、Mg2+0.25 mmol/L、Cl-96 mmol/L、葡萄糖濃度為2.5%， 用HCl或NaOH調(diào)pH值至5.2。TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所），兔來源一抗p-STAT3（ab30647，英國(guó)Abcam公司）、p-JAK2（ab32101，英國(guó)Abcam公司），GAPDH一抗（ab37168，英國(guó)Abcam公司）、二抗（074-1506，美國(guó)KPL公司）。

1.3 模型制備

對(duì)大鼠術(shù)前禁食12 h、禁水4 h以制備失血性休克模型[14]。1%戊巴比妥鈉（1 g/100mL，雙蒸水配制）40 mg/kg腹腔注射麻醉后，行頸總動(dòng)脈和股靜脈穿刺置管術(shù)（一次性使用靜脈留置針24G*19mm/Y，威海潔瑞醫(yī)用制品有限公司），分別用于監(jiān)測(cè)血壓和給藥。經(jīng)右股靜脈行全身肝素化（300 U/kg），經(jīng)左股動(dòng)脈放血造模：行左股動(dòng)脈穿刺置管術(shù)后經(jīng)左股動(dòng)脈放血，于10 min左右使平均動(dòng)脈壓降至（35±5）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并維持該水平1 h，記錄大鼠失血量。Sham組僅行右頸總動(dòng)脈、左股動(dòng)脈、右股靜脈穿刺及全身肝素化；VR組制備模型1 h后經(jīng)右股靜脈采用微量輸液泵回輸放出的血液及兩倍失血量行靜脈復(fù)蘇；NR組模型1 h后行靜脈復(fù)蘇的同時(shí)采用微量輸液泵向腹腔輸注20 mL生理鹽水行腹腔復(fù)蘇，持續(xù)輸注30 min；PR組制備模型1 h后行靜脈復(fù)蘇的同時(shí)采用微量輸液泵向腹腔輸注20 mL P-PDS，行腹腔復(fù)蘇，持續(xù)輸注30 min。

復(fù)蘇24 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，麻醉后開腹，暴露下腔靜脈，采集血標(biāo)本，室溫靜置30 min，4℃，2 500×g 離心10 min，取上清備用，隨即放血處死動(dòng)物，取右側(cè)腎臟，冰生理鹽水洗凈后于冠狀面切為兩半，一半腎臟采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片行HE染色，用普通光學(xué)顯微鏡觀察。另一半腎臟放入液氮中凍存1 h后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存[15]。

1.4 腎組織HE染色與腎小管損傷評(píng)分

經(jīng)4%多聚甲醛固定后的腎組織使用自動(dòng)脫水機(jī)經(jīng)過程序脫水后石蠟包埋，使用自動(dòng)切片機(jī)橫切面4 μm連續(xù)切片，放入60 ℃恒溫烤箱內(nèi)烤片，24 h后進(jìn)行HE染色。使用200倍光學(xué)顯微鏡在室溫下對(duì)染色封片的腎組織結(jié)構(gòu)與形態(tài)、腎小球完整性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行觀察并拍照。根據(jù)腎小管損傷評(píng)分指數(shù)（Paller評(píng)分）進(jìn)行評(píng)分[16]，隨機(jī)選取光鏡下10個(gè)視野，每個(gè)視野選取10個(gè)腎小管，每出現(xiàn)一個(gè)改變則按照以下規(guī)則計(jì)分：腎小管明顯擴(kuò)張、細(xì)胞扁平計(jì)1分；刷狀緣損傷計(jì)1分，脫落計(jì)2分；間質(zhì)水腫計(jì)1分；細(xì)胞空泡變性計(jì)1分；腎小管管腔內(nèi)有脫落壞死的細(xì)胞但未形成管型計(jì)1分，形成管型計(jì)2分；細(xì)胞核固縮計(jì)1分；上皮細(xì)胞顆粒變性計(jì)1分。10個(gè)視野分值累加為Paller評(píng)分，分值越高表明腎小管損傷越嚴(yán)重。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

采用血液分析儀（300-G，美國(guó)雅培公司）檢測(cè)血清血尿素氮（blood urine nitrogen，BUN）和血清肌酐（creatinine，Cr）的濃度，利用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定腎組織 TNF- α和 IL-1β含量（DR-200Bs酶標(biāo)儀，中國(guó)Diatek公司），腎組織p-STAT3、p-JAK2的表達(dá)使用Western blot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩組比較采用事后兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織形態(tài)學(xué)變化與腎小管損傷評(píng)分

光鏡下（200倍）Sham組腎組織切片可見腎單位基本正常，腎間質(zhì)細(xì)胞未見明顯水腫，未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球內(nèi)細(xì)胞排列正常。VR組腎組織切片可見腎單位大體結(jié)構(gòu)存在，但腎小球細(xì)胞萎縮，基底膜斷裂，結(jié)構(gòu)排列混亂，腎間質(zhì)內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量腎小管壞死細(xì)胞團(tuán)塊，有較多炎性細(xì)胞團(tuán)塊聚集，毛細(xì)血管可見淤血及管型存在，近端腎小管可見明顯空泡樣結(jié)構(gòu)，管腔擴(kuò)張，刷狀緣脫落，遠(yuǎn)端小管內(nèi)可見壞死細(xì)胞碎片及其形成的管型，部分腎小管內(nèi)甚至可見淀粉樣物質(zhì)團(tuán)塊。NR組腎組織切片可見腎單位結(jié)構(gòu)基本存在，與VR組相比，其病理損傷程度減輕，腎小球細(xì)胞排列正常，基底膜完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，部分腎小管內(nèi)有管型，刷狀緣脫落，但腎小管細(xì)胞明顯水腫。與VR組、NR組相比，PR組腎病理損傷程度最輕，腎單位結(jié)構(gòu)基本存在，腎間質(zhì)內(nèi)僅可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，刷狀緣基本存在，毛細(xì)血管少量淤血，未見管型形成，但可見腎小管細(xì)胞水腫（圖1）。四組間在Paller評(píng)分上存在顯著差異，VR組（55.0±4.8）評(píng)分最高，顯著高于NR組（32.0±5.4）、PR組（21.4±3.8）與Sham組（9.2±2.9），而Sham組評(píng)分最低（圖2）。

圖1 各組大鼠腎臟組織光鏡下形態(tài)學(xué)變化（HE x200）Figure 1. The morphological changes of rat kidney tissue under light microscope in each group (HE x200)

圖2 各組大鼠腎損傷評(píng)分比較Figure 2. Comparison of rat kidney injury scores in each group

2.2 檢測(cè)指標(biāo)的變化

與Sham組相比，其他3組的BUN、Cr濃度，TNF-α、IL-1β含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VR組、NR組和PR組3組間BUN、Cr濃度和TNF-α、IL-1β含量均呈逐漸下降的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。相較于Sham組，腎組織p-JAK2和p-STAT3蛋白在VR組、NR組和PR組中的表達(dá)均顯著上調(diào)，p-JAK2在PR組表達(dá)量低于其他2組，而p-STAT3在VR組、NR組和PR組3組中的表達(dá)量呈明顯下調(diào)趨勢(shì)（表1）。

表1 各組大鼠腎組織檢測(cè)指標(biāo)比較Table 1. Comparison of the detection indexes of rat kidney tissue in each group

3 討論

失血性休克復(fù)蘇可導(dǎo)致全身器官發(fā)生缺血再灌注損傷[17]。傳統(tǒng)的觀念是休克后及早進(jìn)行靜脈液體復(fù)蘇，恢復(fù)有效血容量以阻止休克造成的器官組織損傷進(jìn)一步發(fā)展。而接受常規(guī)靜脈液體復(fù)蘇的病人卻常常會(huì)發(fā)生多器官功能衰竭，甚至死亡，其原因通常是漸進(jìn)的內(nèi)臟血管收縮、血流灌注不足、全身炎癥反應(yīng)及液體不足等[5]。大量資料表明，失血性休克進(jìn)行靜脈復(fù)蘇后患者內(nèi)臟器官的血流并沒有恢復(fù)，全身炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，細(xì)胞損傷進(jìn)一步惡化，導(dǎo)致患者多器官功能障礙死亡[18]。雖然傳統(tǒng)的復(fù)蘇方法能夠改善包括血壓在內(nèi)的傳統(tǒng)指標(biāo)，但是對(duì)胃腸道及肝腎脾等內(nèi)臟器官灌注狀態(tài)的效果有限。

本研究中，PR組Paller評(píng)分顯著低于VR組和NR組，提示腎小管損傷較小。此外，PR組大鼠血液BUN與Cr的含量也低于其他復(fù)蘇方式。在腎臟發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，TNF-α、IL-1β等炎癥因子起到重要作用[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)抑制TNF-α和IL-1β的水平，可以改善腎缺血再灌注損傷[21-22]。本研究也同樣觀察到腎缺血再灌注損傷時(shí)，TNF-α和IL-1β的水平顯著升高，與其他復(fù)蘇方式相比，采用丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復(fù)蘇顯著降低了TNF-α和IL-1β的水平。以上結(jié)果表明，丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復(fù)蘇改善腎缺血再灌注損傷，其可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

JAK/STAT通路主要由 JAKs蛋白家族和 STATs蛋白家族組成，JAK是 STAT上游靶點(diǎn)，接受細(xì)胞外的細(xì)胞因子信號(hào)刺激并通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而通過JAK/STAT通路廣泛參與細(xì)胞應(yīng)激、生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等。沈誠(chéng)等研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT通路在臟器缺血再灌注損傷中起到關(guān)鍵作用[23]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在腎缺血再灌注損傷中，JAK2/STAT3信號(hào)通路明顯上調(diào)，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)加重了腎損傷[24]。Lu等發(fā)現(xiàn)敲除STAT3基因后，JAK2/STAT3通路受到抑制，腎組織的炎癥及損傷明顯減輕[25]。鄧江濤等發(fā)現(xiàn)丙酮酸鹽腹腔復(fù)蘇能夠降低腸損傷過程中JAK2/STAT3的磷酸化水平，抑制JAK/STAT通路的激活[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)，腎缺血再灌注大鼠的JAK2/STAT3通路明顯激活，進(jìn)一步證實(shí)JAK2/STAT3信號(hào)通路在上述病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。采用生理鹽水腹腔復(fù)蘇可下調(diào)p-STAT3的表達(dá)，而p-JAK2的表達(dá)水平與單純靜脈復(fù)蘇無明顯差異，但丙酮酸鹽腹腔復(fù)蘇可明顯下調(diào)JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平，提示采用丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復(fù)蘇能夠更顯著地抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路。JAK2/STAT3信號(hào)通路能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，也能因炎癥反應(yīng)而被進(jìn)一步激活，本研究后續(xù)將進(jìn)一步研究丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復(fù)蘇與JAK2/STAT3信號(hào)通路及炎癥反應(yīng)三者之間更為具體的調(diào)控關(guān)系。

本研究顯示，丙酮酸鹽腹膜透析液可減輕腎臟的缺血再灌注損傷，降低炎性反應(yīng)，抑制p-JAK2/STAT3蛋白表達(dá)，改善腎功能。其機(jī)制可能與降低炎癥反應(yīng)、抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活有關(guān)。