常見膽道疾病的膽汁微環境改變研究進展

吳 浪，張貫軍，張大涯，陳升鑫，李明陽解放軍醫學院，北京 00853；解放軍總醫院第一醫學中心 消化內科，北京 00853

膽汁大部分由肝實質細胞分泌，每日分泌800 ~ 1 200 mL，流經肝總管、膽囊管，儲存于膽囊內并被濃縮，通過膽管排入十二指腸，以促進脂肪的消化和脂溶性維生素的吸收。膽汁鹽的可用性和肝膽循環的完整性是調節膽汁的重要因素。膽汁作為聯結肝、膽囊、胰腺、十二指腸生理器官的第三間隙液體，其自身存在一個穩定的微環境狀態，由細胞間質及其中體液成分組成，參與細胞的生存。微環境的穩定對細胞正常增殖、分化、代謝和功能活動至關重要，其成分發生異常改變可導致細胞病變，進一步引起疾病的發生發展。近年來，隨著科研技術水平的進步，對于膽汁的各方面研究展現出突飛猛進的發展趨勢，包括膽汁代謝、膽汁成分與疾病之間的病理生理機制、生理結構的改變對膽汁微環境的影響等。本文就膽道系統常見疾病和膽汁的相關研究進展進行綜述。

1 膽汁微環境的改變與膽結石形成的關系

膽結石作為膽道系統的常見病與多發病，其形成受多種因素的影響，包括飲食、生活習慣、肥胖、體質量、遺傳背景、人種差異等，且血清三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、總膽汁酸和總膽紅素水平升高也被證實是膽結石形成的危險因素[1-2]。根據膽結石成分可分為膽固醇結石、膽色素結石、混合型結石三種類型。據現有的文獻檢索，人們對于膽結石形成的研究有上百年的歷史，從理化特性到菌群成分的改變，都對膽結石的形成有著至關重要的作用。研究證實膽道疾病患者細菌感染率高，以單菌種為主，膽汁培養的結果以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主[3]。近30多年來，人們對于膽汁細菌與膽結石形成的研究逐步有了新的認識，由通過培養的方法檢測膽汁中的細菌，到應用聚合酶鏈式反應-脫氧核糖核酸擴增技術，再到半自動細菌鑒定儀，后來發展到現在的宏基因組測序方法等，這一系列技術方面的進步使膽汁中細菌的檢測率逐漸提高，不同成分結石中含有的菌群各不相同[4]，其中通過全基因組鳥槍法測序和16S rRNA測序的方法鑒定出了人類膽道中從未報道過的微生物菌群。近年來對于膽汁微生態相關結石的研究更加全面化，膽結石包括膽囊結石和膽管結石。在新的檢測技術出現后，對于膽管結石膽汁微生態的研究有了更深的探討，16S rRNA高通量測序分析表明膽管結石患者膽道細菌主要為變形菌門與厚壁菌門，其中腸桿菌科尤為豐富[5-6]。有研究表明膽道與十二指腸微生物群之間的組成差異不顯著，在屬水平上排名前3位的核心微生物群是埃希菌-志賀菌、梭桿菌和腸球菌[6]。膽管結石又分為初發膽管結石和復發膽管結石，復發膽管結石與膽管內菌群失調、細菌群落聚集改變、膽汁酸降低有關[7]。有研究從門、屬、種水平上對初發膽管結石與復發膽管結石膽道細菌進行了比較[8-9]，證實了其細菌的豐度和優勢菌群有差異，提示在門水平上復發性膽總管結石病患者的變形菌顯著增高，初發組為厚壁菌門[8-9]。在屬水平上，不同的研究有不同的結論，查秀芳等[8]認為初發組膽管結石患者膽汁中芽孢桿菌屬與乳球菌屬豐度高，復發組摩根菌屬豐度高。而Ye等[9]認為復發組主要為埃希菌。有研究證實膽汁微生物群可能是由更復雜的因素形成，如飲食、生活方式、宿主免疫反應和(或)特定解剖結構，而不是僅由微生物群形成的。Oddi松弛括約肌可以改變膽汁微生物群[5,10]，有助于膽總管結石的復發，其細菌種類較無Oddi括約肌松弛者更富多樣性，結石復發患者梭菌的豐度明顯較高[10]。有研究認為膽汁中細菌的致病機制與β-葡萄糖醛酸酶、磷脂酶和尿素酶的作用有關，甚至細菌的黏液活動導致黏液凝固也能形成膽結石[11]，其致病機制與膽結石形成之間的關系值得進一步探究。

近年來發現膽汁中有機酸、炎癥因子和蛋白水平的改變對膽結石形成有著關鍵影響，這可能為膽結石形成原因提供了不可或缺的理論依據。胰膽管反流誘導的膽囊膽汁中游離脂肪酸和三酰甘油的增加以及膽總管壓力的升高影響著膽結石的形成[12-13]。有研究表明膽汁中IL-1β為非細菌性炎癥反應狀態下膽結石的形成提供了重要的依據，混合結石膽汁中IL-1β含量明顯高于其他類型結石[14]。Rupp等[15]發現了膽總管結石的膽汁液中的91種蛋白質，大多數來源于細胞外間隙，與細胞黏附、補體系統和凝血級聯有關。膽汁蛋白質中HSA和RBP水平的上調、PFN水平的下調以及黏蛋白4促進了膽固醇結石的形成[16-17]。這為膽結石的形成在蛋白組學層面上提供了有力的依據。雖已有大量的理論數據證明了膽結石形成與膽汁微環境之間密不可分的關系，但細菌感染、蛋白組學的改變等與膽結石形成之間的相互作用機制還有待進一步研究，這有助于為預防膽結石形成和治療膽石癥提供一定的科學根據。

2 膽汁微環境的改變與膽管癌發生的關系

膽管癌起源于膽管的上皮組織，為消化系統中致死率很高的惡性腫瘤之一[18]。膽管癌分為肝內、肝門和遠端膽管癌，大部分患者以膽道梗阻引起膽汁引流不暢以及一系列表現為臨床首發癥狀起病，包括腹痛、發熱、黃疸、皮膚瘙癢等。對于影像學表現為膽道狹窄或擴張的患者，需鑒別良惡性，然而目前缺乏特異性診斷方法。臨床上通過血液學腫瘤標志物、磁共振膽胰管成像、增強CT或增強MRI對疾病進行初步的診斷，但對于膽道惡性腫瘤的早期診斷仍存在很大局限性。為解決這一難題，不同研究從不同角度出發探究膽汁微環境的改變對膽道惡性疾病的診斷價值。

從微生態的角度出發，膽道惡性疾病中肺炎克雷伯感染率相對更高[3]。在腫瘤相關性黃疸中，絕大多數細菌存在于膽汁和(或)胰液中，最常見的致病菌為鏈球菌，在內鏡干預前，膽管和胰管梗阻可能存在原始細菌病原體[19]。遠端膽管癌患者與膽管結石患者的膽汁細菌存在差異，遠端膽管癌患者膽汁中最占優勢的門是變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，且芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、氯霉素門、晚孢菌門和普朗克菌門明顯增加[20]。

蛋白質組學研究在膽道惡性腫瘤相關生物標志物方面也有一定進展。癌癥衍生蛋白可通過腫瘤細胞的壞死和凋亡釋放到膽汁中，并在惡性轉化過程中提供有用的信息。雖然有研究證實血清和膽汁的CEA、CA19-9、VEGFR-3、TAC檢測對區分惡性和良性膽道梗阻沒有幫助[21]，但膽汁蛋白質組學譜有利于區分膽管良惡性疾病，這為通過膽汁中的生物標志物診斷膽管癌提供了有力的科學依據。相關研究表明 HSP27、HSP70[22]、SSP411[23]、S100P[24]、CEACAM6[25]、LCN2[26]、α1-抗胰蛋白酶[27]、TPD52和DNAJB1[28]等均有潛力作為膽管癌診斷的膽汁新型生物標志物。良惡性膽道疾病患者的膽汁中蛋白質豐度有差異，與良性膽道疾病患者相比，膽管癌患者膽汁中的免疫球蛋白κ輕鏈、載脂蛋白E、白蛋白、載脂蛋白-ⅰ、抗凝血酶Ⅲ、α1-抗胰蛋白酶、血清轉鐵蛋白、免疫球蛋白重常數μ、免疫球蛋白J鏈、補充C4-A和補體C3水平顯著提高[29]。

為提高膽管癌的診斷價值，膽汁的研究也從宏觀延伸到了微觀。肝外膽管癌直接接觸膽汁液并將癌細胞和凋亡小體轉移到膽汁中。有研究使用基于實時聚合酶鏈反應的甲基化分析證實膽汁中脫氧核糖核酸甲基化標志物是檢測肝外膽管癌的腫瘤生物標志物候選[30]，膽汁中的甲基化也可作為原發性硬化性膽管炎患者膽管癌早期檢測和篩查方法[31]。并且膽汁中游離DNA和膽汁循環腫瘤DNA有可能成為膽管癌診斷的補充方法[32-33]。另外，微小核糖核酸可分為致癌性和腫瘤抑制性，腫瘤進展通過致癌性微小核糖核酸的表達升高或腫瘤抑制性微小核糖核酸的表達降低而加快。有研究表明膽管癌患者膽汁中細胞外miR-30d-5p和miR-92a-3p水平明顯高于良性膽道疾病患者，二者成為鑒別膽管癌的潛在生物標志物[34]。最新的甲基化研究通過聚合酶鏈反應擴增并測序表明膽汁中miR-1247、miR-200a和miR-200b的甲基化可能有助于區分胰膽癌與良性疾病[35]。

作為腫瘤細胞生長的微環境，膽汁中含有相對大量由腫瘤細胞分泌的腫瘤相關蛋白、基因、外泌體等。外泌體攜帶參與細胞信號轉導的蛋白質、微小核糖核酸、環狀核糖核酸和核糖核酸。不同細胞來源的外泌體具有顯著異質性，在許多生物過程中介導細胞間的通訊，在免疫調節、腫瘤轉移、血管生成和疾病發生發展中發揮重要作用。鑒于這些特征，外泌體可作為癌癥診斷和預后的生物標志物[36]。盡管膽汁中的外泌體研究仍處于初級階段，但越來越多的研究已表明外泌體在膽管癌的診斷中扮演著極其重要的角色，最早的關于膽汁外泌體的研究顯示了具有代表性的5種外泌體，包括miR-486-3p、miR-191、miR-1274b、miR-16和miR-484，這有助于確定一種標志物何時唯一地診斷膽管癌，對哪些樣本有一致的診斷，以及哪些標志物互補以產生高預測性的多miR生物標志物，并且這些miR結合起來具有任何兩個miR標記的最高預測值[37]。最近的一項研究報道，膽管癌患者膽汁源性囊泡中circ-CCAC1和hsa_circRNA_100364上調[38]。基于這些方面的研究，膽汁中各種微成分的改變對膽道惡性腫瘤的早期診斷都有指導及借鑒意義，這為膽管癌靶向藥物的研發提供了新的更有說服力的理論依據。

3 膽汁微環境改變對原發性硬化性膽管炎的診斷價值

原發性硬化性膽管炎 (primary sclerosing cholangitis，PSC)是指肝內和(或)肝外膽道系統內膽管發生炎癥、纖維化及狹窄。膽汁可作為膽汁樣細胞的來源，膽汁樣細胞可在體外作為3D類器官長期維持，這些膽汁源性器官有對炎癥刺激做出反應的能力。據推測，膽汁中促炎介質的存在可能反映了膽管細胞的持續炎癥損傷，導致纖維化的發生[39]。在診斷方面，PSC易與膽管癌和其他膽道炎癥狹窄混淆，膽汁微環境改變對PSC的診斷亦提供了一定價值。有研究通過對膽汁細菌16S rRNA基因的V1~V3區進行DNA分離、擴增和Illumina MiSeq測序，發現PSC患者膽汁中常見的門是擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門和放線菌門[28]；最常見的科是普氏菌科、鏈球菌科、韋氏菌科、梭桿菌科和巴氏桿菌科；最常見的屬是普氏菌屬、鏈球菌屬、韋氏菌屬、梭桿菌屬和嗜血桿菌屬。且原發性膽汁性肝硬化的病因學與膽汁微生物群落的變化無關，但鏈球菌屬可能在疾病的進展中起致病作用。另有研究表明膽汁中含有不同于口腔、十二指腸液和十二指腸黏膜的微生物群[40]。PSC患者與膽總管結石和乳頭狀瘤患者均含有以鏈球菌為主要屬的不同核心微生物組，然而PSC患者膽汁中生物多樣性降低，病原體糞腸球菌增加，膽汁中腸球菌的豐度與有害的次級膽汁酸牛磺膽酸濃度密切相關，且膽汁生物失調與促炎劑和潛在致癌劑牛磺膽酸濃度升高有關。

膽汁中蛋白質組學和代謝組學的研究在PSC方面亦有一定程度的進展。通過蛋白質組學方法確定PSC患者的膽道蛋白標志物，與無炎癥或惡性跡象的對照組相比，PSC患者膽道S100A9表達升高95倍[41]，膽汁蛋白質組也顯示出與炎癥和先天免疫反應相關的疾病特異性變化[15]。疾病活動度高的PSC患者的S100A9表達較疾病活動度低的患者顯著升高[41]。膽道S100A9水平可能是PSC活性的標志物，其在炎癥和癌變中的作用值得進一步研究[41]。有研究通過二維差異凝膠電泳檢測PSC患者相對于膽囊癌患者的過表達蛋白質，并通過液相色譜-質譜鑒定，共有101種蛋白在PSC患者的膽汁液中過表達，但未在膽總管結石患者的膽汁液中過表達，其中大多數被預測為細胞內蛋白質，并與核糖體和蛋白酶體途徑相關[15]。與炎癥和先天免疫反應相關的蛋白質，如分化簇14、膜聯蛋白-2和補體系統的成分，在PSC中上調。從代謝組學分析PSC患者膽汁的特征，發現PSC的膽汁中富含二肽和多胺代謝物[42]，這些代謝物在非膽汁淤積性肝病中更加均勻。膽汁中蛋白質組學和代謝組學的改變有望為PSC患者提供早期診斷信息，有助于未來治療藥物的研發。

4 結語

膽道系統疾病相關領域的各種研究層出不窮，不同疾病膽汁中的優勢菌群與菌群豐度存在差異，致病性菌群及益生菌對膽汁的影響有各自的作用機制，蛋白質、代謝物的成分與含量因疾病而異。外泌體作為雙層脂質膜結構的囊泡，不同來源外泌體的靶向性和功能可能有所不同[43]。在炎癥環境下，外泌體可促進細胞的增殖和遷移[44]，且與腫瘤發生、轉移有密不可分的關系[45-46]。近年來，技術的更新使研究者能夠從膽汁中提取外泌體，有關膽汁中外泌體的研究開始受到了越來越多的關注。

對于臨床表現相同的膽道疾病，可有不同的病因，由于生理結構的特殊性，在取材和診斷方面有很大難度，導致在治療時有時會很棘手。因此探索膽道系統不同疾病的微生態變化情況，有助于為疾病的診斷、治療和預防以及靶向藥物的研發提供科學依據。然而，膽汁微生態變化與膽道疾病發生的關系及致病機制還需要更加深入的探索，這也是未來我們解決問題的出發點之一。