鏈球菌改進咪喹莫特誘導銀屑病樣皮炎動物模型的研究

劉承靈，王祎琳，張 璇，王婧宇，仁 丹，柏 佳，趙 華 解放軍醫學院，北京 0085； 解放軍總醫院第一醫學中心 皮膚科，北京 0085； 解放軍總醫院醫學創新部 醫院管理研究所，北京 0085

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，主要表現為軀干、四肢散在分布境界清楚的鱗屑性紅斑和丘疹。銀屑病發病機制復雜，涉及遺傳、自身免疫、環境等多方面因素[1-2]。銀屑病嚴重影響患者生活質量，目前藥物治療無法根治，其機制研究以及治療方法的探索與評價是關注熱點。建立一種便捷、穩定且符合臨床病理特點的動物模型非常重要。目前用于研究銀屑病的動物模型大致分為自發動物模型、轉基因動物模型、咪喹莫特(imiquimod，IMQ)誘導模型和移植模型，方法眾多，各有優缺點，但都不能完全模擬人體銀屑病的發病規律[3]。目前最常用的銀屑病樣皮炎動物模型為咪喹莫特誘導的動物模型，因其操作便捷、相對實用且皮損及病理表現與臨床銀屑病類似程度高而被廣泛使用。但由于成功造模后維持時間短，在一定程度上影響疾病機制研究及治療藥物的效價評價[4]。因此一種相對穩定延長皮損持續時間的模型具有一定意義。臨床上發現，鏈球菌可導致銀屑病的發生及病情加重，通過鏈球菌激發免疫反應從而建立多種免疫相關炎癥性疾病動物模型(如IgA腎炎、類風濕性心瓣膜炎、自身免疫性腦炎)已有報道[5-10]。故我們采用文獻報道的感染鏈球菌的方式刺激小鼠誘發免疫反應[11-12]，期待可延長皮損的持續時間、加重銀屑病的皮損表現，形成更加穩定的動物模型。

材料與方法

1 實驗動物 C57BL/6 小鼠 45 只，雌性，SPF級，6 ～ 8 周齡，體質量 18 ～ 22 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2019-0010，實驗動物合格證號：110324210100639426。小鼠飼養于SPF級動物實驗室，飼養期間自由攝食飲水，控制環境溫度為18℃～24℃、相對濕度為 40% ～ 70%，明暗交替12 h。所開展的實驗均經解放軍總醫院實驗動物中心倫理審查委員會批準(倫理批號：2021-X17-67)。實驗中涉及的方法均根據動物實驗相關指南和法規進行。2 藥品及儀器設備 二氧化碳恒溫細胞培養箱(SANYO公司，日本)，麥式細菌比濁儀(齊威儀器有限公司，杭州)，普通離心機(安亭科學儀器廠，上海)，小動物氣體麻醉機(玉研科學儀器公司，上海)，石蠟旋轉切片機(輔光精密儀器有限公司，上海)，哥倫比亞血培養基(科碼嘉有限公司，上海)，實驗用異氟烷(上海玉研科學儀器公司，上海)，咪喹莫特乳膏(3M中國有限公司，上海)，醫用黃凡士林(vaseline，VAS；解放軍總醫院藥劑室，北京)，A族β溶血鏈球菌株(group A streptococcus，GAS；北納創聯生物技術研究院BNCC 3371100，北京)，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS；普諾賽，武漢)，小鼠白細胞介素(interleukin，IL)-17、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 酶 聯 免 疫 吸 附實驗(ELISA)試劑盒(江萊生物公司，JL20250、JL20257、JL20268，上海)，Ki-67抗體(Abcam公司，ab15580，美國)。

3 銀屑病模型的建立及小鼠分組處理 1)細菌準備：將A族β溶血鏈球菌株充分活化，鋪滿整個血培養基，放入37℃、5% CO2培養箱中12 h后，進行顯微鏡下菌株鑒定。確定擴增成功后，從母板上取一接種環的細菌在新的肉湯液體培養基中繼續擴增，然后置于37℃、5% CO2培養箱中進行培養。16 h后離心過濾收集液體培養基中的菌落，采用比濁法測定細菌的數目，用PBS溶液配置終濃度為 2 × 1010CFU/mL 的細菌溶液。2)動物準備：小鼠適應性飼養后按照隨機數字表法分為鏈球菌組 (GAS + IMQ)、咪喹莫特組 (PBS + IMQ)和空白組 (PBS + VAS)，每組15只。實驗開始時，每只小鼠背部皮膚用電動剃毛器刮除2 cm ×3 cm大小矩形毛發。造模第1天，鏈球菌組小鼠每只鼻孔接種配置好的細菌菌液，每側5 μL，咪喹莫特組、空白組小鼠每側鼻孔接種等量PBS溶液。3)動物處理：造模第3天起，空白組每日在小鼠背部涂抹醫用凡士林；鏈球菌組、咪喹莫特組每日在小鼠背部涂抹咪喹莫特乳膏62.5 mg/(2 ×3 cm2·d)后充分按摩，持續涂抹 21 d。每組在造模的第0、3、10、17、24天隨機處死3只老鼠并留取皮損組織標本，背部皮膚組織用10%甲醛緩沖液常溫保存。造模第24天采取摘眼球取血法留取每只小鼠血液標本 0.5～1 mL，3 000 r/min 離心15 min，取上清待測。

4 皮損評分 參考銀屑病皮損面積及嚴重程度指數 (psoriasis area and severity index，PASI)評估皮損的嚴重程度。實驗第3天開始，每日對皮損的紅斑、鱗屑、厚度進行評分，并將3項得分相加得到總分。PASI評分標準：紅斑，0分為無紅斑，1分為紅斑呈淡紅色，2分為紅斑呈紅色，3分為紅斑呈深紅色，4分為紅斑極深；鱗屑，0分為表面無鱗屑，1分為部分皮損表面上覆有鱗屑，2分為大多數皮損表面覆蓋有鱗屑，3分為皮損部位幾乎全部被鱗屑覆蓋且鱗屑呈層狀，4分為皮損部位全部被鱗屑覆蓋；厚度，0分為皮損與正常皮膚齊平，1分為皮損較正常皮膚表面稍高，2分為皮損中等度隆起，3分為皮損肥厚且隆起明顯，4分為皮損高度肥厚且明顯凸起。各組總分取平均值繪制曲線。

5 小鼠皮損組織病理及大體觀察 每日對小鼠皮損進行拍照留存，將留存的三組小鼠背部皮損組織固定于10%甲醛溶液中，經標本脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色。顯微鏡下觀察組織病理形態。

6 ELISA 檢測小鼠血清中 IL-17、IL-6、TNF-α 的表達 將獲取的待測血清標本按照試劑盒的說明書進行細胞因子濃度的測定，在IL-17、IL-6、TNF-α細胞因子檢測板中加入樣本(稀釋5倍)或對應的標準品并設置對照，加檢測抗體孵育，洗板，加酶孵育，洗板，加入顯色劑顯色反應5 ～30 min后，加終止液使反應終止，10 min內在酶標儀設置參考波長 610 ～ 630 nm，檢測波長 450 nm，測出各孔吸光度值，通過標準曲線計算樣品中各細胞因子的含量。

7 免疫組化檢測小鼠皮膚中 Ki-67 的表達 將留存的各組小鼠皮損組織石蠟切片脫蠟水化，封閉，加抗原修復液進行冷修復，一抗4℃孵育過夜。次日室溫放置30 min后，先滴加反應增強液室溫反應10 min，后滴加二抗，室溫反應20 min，DAB 顯色 5 ～ 8 min，蘇木精復染 20 s，脫水，封片，顯微鏡觀察Ki-67的表達情況。

8 統計學分析 采用 Graphpad Prism 8 和 SPSS 23.0進行統計分析和圖片繪制，使用iViewer軟件觀察測量HE組織標本表皮厚度，使用Image J軟件計算免疫組織化學染色標本Ki-67陽性細胞比例。觀測資料均為計量資料，以±s表示，多組樣本均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠皮膚大體形態觀察及皮損 PASI 評分 第0 ～ 3天三組小鼠皮膚均光滑平整(圖1)。與空白組相比，鏈球菌組、咪喹莫特組小鼠在第4天即出現輕微鱗屑，皮膚微發紅；隨后鱗屑增多，皮損面積蔓延擴大，部分紅斑表面覆厚重鱗屑，紅斑顏色加深；PASI評分開始上升(圖2)，鏈球菌組評分高于同期咪喹莫特組。鏈球菌組和咪喹莫特組小鼠第10天鱗屑布滿背部皮膚，上覆厚重鱗屑，紅斑呈深紅色。皮損PASI評分達到頂峰。咪喹莫特組小鼠第10天后皮損鱗屑面積開始減少，厚度減小，紅斑顏色減退，第17天鱗屑進一步減少伴少量淡紅斑，第24天僅見部分菲薄的鱗屑。鏈球菌組第10 ~ 24天皮損保持較為穩定，同期皮損PASI評分均顯著高于咪喹莫特組(P＜0.05)。

圖1 小鼠實驗造模第 0、3、10、17、24 天背部皮損情況Fig.1 Skin lesions of mice on day 0, 3, 10, 17, 24

圖2 小鼠不同時間點背部皮損PASI評分(aP＜0.05，vs PBS+IMQ)Fig.2 PASI scores of dorsal skin lesions in mice at specific time points (aP＜0.05, vs PBS+IMQ)

2 小鼠皮膚組織病理及表皮厚度改變 第 0、3天鏈球菌組和咪喹莫特組小鼠皮膚結構大致正常。第10天鏈球菌組和咪喹莫特組表皮均明顯增厚，伴角化不全、角化過度、炎性細胞浸潤、顆粒層變薄、棘突延長等。第17 ~ 24天咪喹莫特組表皮厚度明顯減小，鏈球菌組表皮厚度減小不明顯。見圖3、圖4。

圖3 小鼠實驗造模第 0、3、10、17、24 天皮損組織病理 (HE，200×)Fig.3 Histopathological changes of skin lesions in mice on day 0, 3, 10, 17, 24 (HE, 200×)

圖4 小鼠實驗造模第 0、3、10、17、24 天表皮厚度比較 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)Fig.4 Comparison of epidermis thickness in mice on day 0, 3, 10,17, 24 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)

3 實驗第 24 天小鼠血清 TNF-α、IL-17、IL-6 表達水平 造模第24天，與空白組相比，鏈球菌組和咪喹莫特組小鼠血液中IL-17和IL-6、TNF-α含量均升高，且鏈球菌組均顯著高于咪喹莫特組(P＜0.05)。鏈球菌組與空白組 TNF-α、IL-6 、IL-17 細胞因子水平差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖5。

圖5 實驗第24天小鼠血清TNF-α、IL-17、IL-6表達水平 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)Fig.5 Expression levels of TNF-α, IL-17, IL-6 in sera of mice on day 24 (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)

4 造模第 24 天小鼠背部皮損組織 Ki-67 表達造模第24天，鏈球菌組小鼠皮膚基底層Ki-67陽性細胞百分率顯著高于咪喹莫特組和空白組(35.23%±3.26%vs24.30%±4.23%、13.73%±1.50%，P均＜0.05)。見圖6。

圖6 實驗第24天小鼠背部皮膚Ki-67陽性表達A:免疫組織化學染色(200×)；B:Ki-67陽性率(aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)Fig.6 Expression level of Ki 67 in mice dorsal skin of each group on day 24 A: immunohistochemistry staining (200×); B: Ki-67 positive percentage (aP＜0.05, vs PBS+IMQ; bP＜0.05, vs PBS+VAS)

討 論

銀屑病是一種T細胞介導的免疫性疾病，可見于任何年齡段人群，常反復發作，亞洲成年人發病率約為0.14%[13]。主要炎癥通路為IL-23/Th17軸的異常激活。銀屑病患者皮損中可見數量不等的中性粒細胞、樹突狀細胞和淋巴細胞等免疫細胞的浸潤；在銀屑病患者血清中可發現TNF-α、IL-6、IL-17等細胞因子明顯升高，說明多種免疫細胞和細胞因子參與Th17為主的免疫反應[14-16]。銀屑病動物模型主要分為轉基因動物模型、咪喹莫特誘導模型、異體移植模型等。轉基因模型皮損表達較為穩定，但不能很好地模擬銀屑病的發病規律且造價昂貴；異體移植模型因造模困難，條件苛刻而受限[3]。目前研究銀屑病主要采用咪喹莫特誘導的銀屑病樣皮炎動物模型。咪喹莫特是一種Toll樣受體激動劑，可特異性激活Toll-7/8受體，促進γ干擾素產生，刺激樹突狀細胞激活Th17細胞免疫反應從而模擬銀屑病樣皮損，皮損在第7天左右最嚴重，1周后逐漸消退，給研究帶來不便[17-18]。Horváth等[19-20]使用小型斑貼器改良動物模型，該模型可減少咪喹莫特的使用量，有效減少藥物經皮吸收后對動物全身的不良影響。修緩娟等[21]通過皮下注射IL-12和脂多糖的方法，延長銀屑病小鼠模型持續時間。

GAS是一種革蘭陽性球菌，可在人體扁桃體中大量定植。研究發現GAS感染引發的免疫反應與IgA腎炎、類風濕心瓣膜炎、自身免疫性腦炎等免疫疾病密切相關，鏈球菌感染誘導的上述疾病動物模型已被廣泛應用[5-10]。Groot等[22]的大樣本隊列研究顯示，鏈球菌的感染與點滴型銀屑病發生和慢性斑塊型銀屑病癥狀加重相關，并可以通過抗感染治療銀屑病。GAS主要通過其菌壁上的超抗原如M蛋白、制熱素蛋白、熱休克蛋白以及細菌內的甲基化DNA等作為抗原刺激并誘發T細胞相關免疫反應[23-24]。Ferran等[25]發現鏈球菌可特異性激活皮膚淋巴細胞相關抗原T細胞產生Th1、Th17類型的細胞因子參與銀屑病角質形成細胞的異常增殖。Wang等[26]研究證實鏈球菌可以通過激活Toll-2受體以及產生轉化生長因子β從而激活Th17免疫反應，在細胞水平上證實感染鏈球菌后機體產生的免疫反應與銀屑病發病通路高度類似。

本研究以鏈球菌感染小鼠從而改良銀屑病樣皮炎動物模型[11-12]，使其皮損表現更顯著、更穩定，持續時間更長。從小鼠大體皮損、PASI評分、皮損組織病理及表皮厚度等可看出，感染鏈球菌的小鼠皮損持續時間延長，皮損表現更典型、更穩定。反映炎癥程度的細胞因子TNF-α、IL-6、IL-17在鏈球菌組中明顯升高，說明鏈球菌感染小鼠的炎癥程度更為劇烈。Ki-67是一種反映細胞增殖程度的指標，是銀屑病中增殖活性的經典標志物[27]。免疫組化結果顯示，鏈球菌組小鼠基底層細胞增殖更活躍。綜上提示鏈球菌可能通過角質形成細胞的異常增殖加重銀屑病樣皮損。另外本實驗中還觀察到銀屑病樣皮炎小鼠模型在連續涂抹咪喹莫特后皮膚顏色變黑，鼠毛生長更為旺盛，提示長期外用咪喹莫特可能對老鼠皮膚及毛發生長有影響，但有待進一步證實與研究。

本研究以鏈球菌感染的方式改良銀屑病樣皮炎動物模型，此前未見報道。對比傳統模型，鏈球菌感染的銀屑病樣皮炎動物模型皮損表現更典型、更穩定，持續時間更長。但本研究未探討其具體機制，亟待后期研究加以完善。綜上，鏈球菌感染可改良銀屑病樣皮炎動物模型，可能是一種可行且具備良好效果的動物模型。