硫酸新霉素制藥廢水好氧活性污泥中優勢硝化菌的分離鑒定及實驗研究

吳媛媛，樂超銀，龔大春，謝飛

（1.三峽大學 生物與制藥學院，湖北宜昌 443002；2.宜昌三峽制藥有限公司，湖北宜昌 443002）

在全面控制污染物排放專項整治行動中，原料藥制造行業屬于十大重點行業之一，制藥（抗生素、維生素）行業需嚴格控制其廢水污染物排放。制藥廢水因污染物質組分復雜，氨氮含量高，且包含有生物抑制物、有毒有害物質而難以被微生物自然降解，因此抗生素類制藥廢水的處理是一個棘手問題。在制藥廢水生化處理過程中，脫氮菌是影響生物脫氮效果的關鍵因素，發掘新型的高效脫氮菌對生物脫氮技術在廢水處理中的運用具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實驗儀器

LDZM-80KCS壓力滅菌器，上海申安醫療器械廠；VS-1900凈化工作臺，蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；Applied Biosystems 2720熱循環儀，美國賽默飛世爾公司；GWA-UN4-F20超純水器，北京普析通用儀器有限公司；FR980凝膠成像儀，上海復日科技儀器有限公司；TH2-C恒溫搖床，太倉市實驗設備廠；FE28型酸度計，瑞士梅特勒-托利多公司；Applied Biosystems 3730XL測序儀，美國賽默飛世爾公司；DT5-6A離心機，北京時代北利離心機有限公司；SHH-250L生化培養箱，重慶康城永生試驗設備有限公司；E100光學顯微鏡，日本尼康公司；Cary 60 UV-Vis分光光度計，美國安捷倫公司。

1.1.2 試劑

NaCl、MgSO4·7H2O、Na2CO3、CaCO3和NaH2PO4，AR級，成都市科隆化學品有限公司；K2HPO4、KH2PO4、CH3COONa、(NH4)2SO4和MnSO4·H2O，AR級，西隴科學股份有限公司；FeSO4·7H2O、NH4Cl，AR級，國藥集團化學試劑有限公司；無水葡萄糖，AR級，中國惠興生化試劑有限公司。

1.2 樣品與培養基

1.2.1 樣品來源

活性污泥樣品采集自湖北省宜昌市三峽制藥有限公司生化池。使用前先用純化水進行清洗處理：用250 mL燒杯裝入一半容積的污泥，加入等體積純化水后，玻璃棒攪拌1 min，靜置沉降30 min，去除上層水洗液，重復3次后備用。同時取樣進行宏基因測序，分析目標樣品內微生物結構豐度。

1.2.2 培養基

（1）富集培養基。富集培養基A：NH4Cl 0.8 g、NaNO20.5 g、KH2PO44.0 g、MgSO4·7H2O 0.4 g和 Na2CO30.8 g，加水 2 000 mL，pH 7.4，121 ℃高溫滅菌15 min。富集培養基B：NaNO22 g、NaCl 1 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 1 g、FeSO40.8 g 和Na2CO32 g，加水 2 000 mL，pH 7.8，121 ℃高溫滅菌15 min。

（3）硝化培養基培養基。NH4Cl 0.4 g、NaCl 0.12 g、K2HPO40.2 g、CH3COONa 2 g、MgSO40.05 g、MnSO40.01 g和FeSO40.01 g，加水1 000 mL，調節pH值7.2，添加18 g/L的瓊脂，121 ℃高溫滅菌15 min。

（4）反硝化培養基。NaNO20.05 g、NaCl 3 g、KH2PO42 g、CH3COONa 1 g、NaH2PO43 g和無水葡萄糖10 g，加水1 000 mL，調節pH值7.2，添加18 g/L的瓊脂，121 ℃高溫滅菌15 min。

1.3 硝化菌富集培養及菌株分離

取經過前處理的活性污泥20 mL分別加入裝有100 mL無菌富集培養基的250 mL三角瓶中。30 ℃、180 r/min恒溫搖床中富集培養72 h；轉接后，再次富集。將富集液進行梯度稀釋（10-2～10-4）后，分別涂布于、硝化和反硝化固體培養基上，30 ℃恒溫培養至出現明顯單菌落[1]。

1.4 硝化菌的篩選

將分離得到的菌株分別接種到富集培養基中，在30 ℃、180 r/min的搖床中培養24 h。將初篩選出的菌株（OD600約為1.0）按5%的接種量接種于液體培養基中，在30 ℃，180 r/min搖床中培養[2]。分別在培養0 h、24 h、48 h、72 h后取樣檢測總氮（TN）、氨氮、硝態氮和亞硝態氮濃度，選取脫氮效果良好的菌株。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 形態學鑒定

1.5.2 16 S rDNA分子鑒定

按SK8255（細菌）試劑盒操作說明提取基因組DNA。采用16S rDNA通用引物：27F（5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’） 和 1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）；7F（5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’） 和 1540R（5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）進行PCR擴增。菌株由上海生工生物完成16S rDNA分子鑒定。將16S rDNA序列結果在核糖體數據庫（http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp）中進行比對，搜索相似性較高的模式菌株及其基因序列。

1.6 生長曲線的測定

目標菌液（OD600約1.0）按5%體積比接種于液體培養基中，在30 ℃、180 r/min搖床中培養，定期取樣測定菌液在600 nm處吸收值，繪制生長曲線。

2 結果與分析

2.1 好氧活性污泥微生物結構豐度分析

如圖1所示，硫酸新霉素制藥廢水的好氧活性污泥中優勢菌為變形菌門（47.85%），可能存在4種變形菌：β-變形菌（Betaproteobacteria），22.46%；γ-變形菌（Gammaproteobacteria），12.01%；ɑ-變形菌（Alphaproteobacteria），8.84%；δ-變形菌（Deltaproteobacteria），3.97%。

圖1 活性污泥中的微生物群落分類學系統樹狀圖

2.2 硝化細菌的篩選

2.3 細菌分離鑒定

2.3.1 形態學觀察

3株細菌的主要形態學特點見表1。

表1 菌株的菌落形態特征

2.3.2 不同菌株對氨氮、亞硝態氮、總氮降解效果

圖2 不同菌株對總氮、氨氮、亞硝態氮和硝態氮的去除效果

2.3.3 優勢菌株A1的染色鑒定

對目標菌株A1進行染色，結果顯示為革蘭氏陰性菌，呈短桿或球桿狀，見圖3。

圖3 菌株A1在顯微鏡下觀察的形態結果

2.3.4 菌種鑒定

對目標菌株A1進行16S rDNA測序分析，發現與泛養副球菌（Paracoccus pantotrophus）DSM 2944的1號染色體完整序列相似性水平達到100%。結合菌株的形態學特征及菌種鑒定結果，確定其為泛養副球菌（Paracoccus pantotrophus），見表2。

表2 基于目標菌株16S rDNA 序列測定結果

2.4 菌株A1生長曲線測定

由圖4可知，在培養初期細菌生長速率緩慢，12 h后進入對數生長期，48 h左右到達穩定期。

圖4 菌株A1的生長曲線

3 結論

本實驗對硫酸新霉素制藥廢水處理中的好氧活性污泥的微生物菌群結構采用宏基因組技術進行了解析。研究結果表明，從門水平而言，好氧污泥中細菌類型主要為變形菌門（豐度47.85%）和擬桿菌門（豐度11.77%），其中硝化螺菌屬豐度為0.75%；通過宏基應組測序對主要差異物種進行解析，好氧污泥中豐度最高的變形菌門可能存在著4種變形菌屬，分別為α-變形菌、丙型變形菌、β-變形菌、δ-變形菌；從污泥樣本中分離篩選出3株具有硝化能力的菌株，其中菌株A1具有較好的硝化能力，經鑒定為泛養副球菌（Paracoccus pantotrophus），與污泥中高豐度菌門結果一致，A1除有明顯脫氮效果外，還表現出反硝化功能。該研究發現對硫酸新霉素制藥廢水處理研究具有重要意義，今后將結合實際對菌株脫氮條件進行優化，為制藥廢水脫氮工程實踐應用提供依據及經驗。