TGF-β及其信號通路在肝臟疾病中的研究進展

葉 森，王宏賓，付 永

(1.青海大學 研究生院，青海 西寧 810016；2.青海大學附屬醫院 普通外科，青海 西寧 810000；3.青海省畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016)

肝功能受損可影響機體的各個系統，肝臟疾病比任何導致機體功能失調的疾病都具威脅性。病毒性肝炎、寄生蟲、酒精、藥物等造成的肝纖維化、肝硬化、肝癌等是最常見的死亡原因之一，嚴重影響患者日常生活及預后[1-2]。近年來隨著臨床研究的不斷深入，炎癥相關細胞因子，如干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、白細胞介素(interleukin, IL)-2等在肝臟疾病病理、生理過程中的作用逐漸明確，并被證實參與了諸多免疫應答。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)在肝臟疾病的發生、發展中同樣發揮主導作用。因此，了解TGF-β及其信號通路在肝臟疾病中的具體作用機制，對肝臟疾病的進一步研究及治療具有重大臨床意義。

1 TGF-β及其信號通路

1.1TGF-β組成 根據序列相似性和信號特異性，可將TGF-β超家族進一步分為TGF-β、激活素、抑制素、Nodal、骨形態發生蛋白 (bone morpho-genetic protein, BMP)、生長分化因子(growth differentiation factor, GDF)、膠質細胞源性神經營養因子(glial cellderived neurotrophic factor, GDNF)和繆勒氏管抑制物(mullerian in-hibitor substance, MIS)等。TGF-β在胚胎發育過程中組織細胞形成及維持細胞穩態中均發揮重要的調節功能[3]。TGF-β在機體大多數細胞中均可表達，在機體正常生長、發育和保持機體平衡中起主導作用。TGF-β的主要配體有3種：TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3，三者具有相似的生物活性，通過旁分泌和自分泌途徑調節細胞功能，在機體細胞增殖、凋亡、分化及類固醇生成等過程中起重要作用。TGF-β還有3種相對應的TGF-β受體(transforming growth factor-β receptor, TβR)：TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ和TβR-Ⅲ[4]。Smads蛋白作為細胞信號轉導蛋白，活化后在TGF-β信號通路中發揮關鍵作用，能夠將TGF-β信號從細胞外轉移至細胞核，進而發揮重要的生物學功能。根據各自特有的結構和功能，Smads蛋白可分為3種不同的亞型：受體活化型或通路限制性Smad(R-Smads)、共同通路型Smad(co-Smads)和抑制性Smad(I-Smads)。R-Smads為Ⅰ型受體Smads激酶的底物，活化TGF-β信號通路的胞內轉導，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，其中Smad2、Smad3被TGF-β磷酸化，BMP受體使Smad1、Smad5、Smad8磷酸化，故TGF-β信號通路的重要參與者為Smad2及Smad3，而Smad1、Smad5、Smad8則參與了BMP信號的傳遞過程[5-6]。Co-Smads包括Smad4，主要起輔助TGF-β/Smads信號通路進行胞內轉導的作用。I-Smads包括Smad6及Smad7，具有保守的羧基端MH2結構域，但與R-Smad、co-Smad比較，氨基酸末端區域高度分化。Smad6優先抑制BMP I型受體ALK-3和ALK-6啟動的Smads信號，而Smad7則抑制TGF-β和BMP誘導的Smads信號傳導，此外，I-Smads還調節一些非Smads信號通路。研究表明，I-Smads功能的發揮受各種酶的調節，包括泛素連接酶、乙酰轉移酶、脫乙酰酶和甲基轉移酶等，但這些酶的具體作用機制有待進一步研究[7-8]。

1.2TGF-β信號通路

1.2.1經典的TGF-β/Smads信號通路 正常情況下，TGF-β存在于細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，完全處于靜止狀態。信號開始傳遞的標志是TGF-β的一個配體首先與TβR-Ⅱ結合，將TβR-Ⅰ、TβR-Ⅲ匯聚，然后TβR-Ⅰ發生磷酸化，TGF-β/Smads信號就發生了。磷酸化后的TβR-Ⅰ繼續在其羧基末端的絲氨酸殘基(pSmad2/3C)上將Smad2及Smad3相繼磷酸化，進而招募Smad4并與之形成復合體，實現信號從細胞外轉移至細胞核，調控相應靶基因的轉錄[9-10]。

1.2.2非經典的TGF-β信號通路 除了Smads介導的經典TGF-β信號通路外，TβR還能通過各種化學方式，如磷酸化或者直接作用等，來激活細胞內的其他信號通路，如細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)、絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinases, MAPK)及RhoA/ Rho激酶(RhoA/Rho kinase, RhoA/Rock)信號通路等，稱之為非經典的TGF-β信號通路[11]。研究發現，TGF-β激活后可以依次活化ERK、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase, p38MAPK)/JNK及Rock等信號通路，參與調控細胞的正常生長、遷移、免疫抑制及內皮間質轉換[12]。

2 TGF-β及其信號通路與肝臟疾病

肝臟疾病影響著全世界數以百萬計的人。由于全球現代肝臟疾病學的預防、診斷和治療的不斷進步，在大多數發達國家慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的發病率正在急劇下降[13]。乙型病毒性肝炎抗病毒系統綜合免疫治療方案的不斷擴大，大大減少了包括中國在內的許多國家的新感染病例數。但是，CHB仍然是嚴重威脅我國居民身體健康的慢性傳染疾病之一。此外，由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、細菌、寄生蟲感染及飲酒、飲食等原因引起的肝纖維化、肝硬化及肝癌仍引起社會各界密切關注[14-15]。以下分別闡述TGF-β及其信號通路在CHB、肝纖維化、肝癌、肝棘球蚴病中的研究進展。

2.1TGF-β及其信號通路與CHB 研究表明，CHB可引起單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷(natural killer, NK)細胞、T細胞的天然免疫和適應性免疫功能障礙[16]。TGF-β1影響機體免疫細胞的發育和成熟，維持機體免疫耐受和平衡，調節免疫反應的各個方面，在CHB發生發展中發揮關鍵作用[17]。輔助性T細胞17 (T helper cell 17, Th17)、調節性T細胞(regulatory T cell, Treg)在CHB的發生發展中發揮重要的作用，Treg主要通過細胞膜表面的分子與細胞直接接觸的方式發揮作用，誘導產生細胞因子IL-10和TGF-β發揮作用。Th17源于原始的輔助性T細胞，與Treg作用相反，正常情況下兩者保持平衡，維持機體的免疫穩定。有研究表明，CHB患者外周血中Treg相關細胞因子IL-10、TGF-β1及Th17相關細胞因子IL-23的表達顯著升高，充分證實Th17/Treg平衡參與CHB的發生、發展，而TGF-β1作為Treg代表性細胞因子通過影響Th17/Treg平衡間接參與CHB的發生、發展[18]。

研究還發現，機體健康肝細胞表達TGF-β1較少，但隨著HBV的感染，肝細胞相繼發生變性、壞死、纖維化，共同作用于Kupffer細胞，刺激其合成、分泌大量的TGF-β1[19]。同時相關研究也證實CHB患者外周血TGF-β1水平明顯高于健康對照組，與HBV-DNA荷載量呈明顯的正相關[20]。進一步研究發現，TGF-β1與CHB抗病毒藥物治療的實際療效相關，目前臨床常用的抗病毒藥物，如阿德福韋酯及恩替卡韋等，均可引起HBV-DNA滴度明顯下降，進而使TGF-β1水平顯著降低[21]，充分證實了TGF-β1水平可作為反映CHB患者抗病毒治療效果以及機體炎癥因子平衡狀態的一項重要指標。Li等[22]為探討炎癥細胞因子與CHB發生、發展的關系，選取HBV包膜抗原(HBeAg)陽性患者250例進行研究，測定患者入院時的血清學指標和TGF-β水平，結果發現，TGF-β是CHB的獨立影響因素。研究發現，乙肝病毒x蛋白(hepatitis B virus x protein, HBx)可以通過與Smad4的直接作用激活TGF-β途徑[23]，而Smad7在抗病毒治療成功后炎癥消退的過程中被表達上調[24]。后續仍需進一步的研究闡明TGF-β參與CHB發生、發展的具體機制。

2.2TGF-β及其信號通路與肝纖維化 肝纖維化是機體對各種致病因素導致肝細胞慢性損傷進行功能修復時發生反應進而引起的慢性肝臟疾病。多種致病因素，如HBV、寄生蟲、乙醇、藥物、脂肪肝、自身免疫性疾病等，均可直接引起肝纖維化，并進一步形成肝硬化，甚至肝癌[25]。其中涉及的重要機制是，肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)激活轉變為肌成纖維細胞(myofibroblast, MFB)，導致膠原蛋白合成增多，并過量聚積。多種信號通路參與了肝纖維化的發生，其中在正常肝組織中表達較低而在肝組織受損時被激活且表達增加的TGF-β被認為是肝纖維化發生的關鍵因子。在正常肝臟中，HSCs以靜止的非增殖狀態存在。在急性和慢性肝損傷期間，ECM中的TGF-β被激活，并在各種細胞中表達和釋放。這種情況下，TGF-β的一個重要靶點是誘導激活并轉化為MFB的HSCs，具體機制包括細胞內維生素A的丟失、成纖維細胞形狀的適應以及收縮、增殖和遷移表型的形成等[26]。ECM主要來源于激活的HSCs、骨髓源性纖維細胞、發生上皮間質轉化(epithelialmesenchymal transition, EMT)的肝細胞和發生EMT的膽管細胞。正常肝臟中的ECM處于生成和降解平衡，當發生肝損傷時，肝臟愈合反應使ECM沉積過多而導致纖維瘢痕增生最終發生肝纖維化[27]。進一步研究證明，TGF-β1可通過上調主要ECM蛋白(如纖維連接蛋白和膠原)、整合素、基底膜蛋白(如層黏連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白和巢蛋白)的表達使ECM增多；在調節ECM功能方面，TGF-β1可在傷口愈合反應中誘導ECM中肌腱蛋白表達，該蛋白在正常肝組織中幾乎不表達，但在纖維化肝組織內可促進細胞的遷移和增殖[28]。

下游分子Smad3被認為是TGF-β活化HSCs導致纖維化的主要介質。研究表明，Smad3和維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)存在關聯，TGF-β信號在HSCs的全基因組VDR結合位點(VDR順反子)中產生再分配，通過TGF-β介導的染色質重塑，促進VDR與Smad3依賴性靶基因啟動子的結合，從而使纖維形成，基于這一機制，VDR配體可抑制TGF-β誘導的HSCs激活，并消除肝纖維化[29]。相關研究表明，Smad7對TGF-β負性調節作用機制為通過上調DNA甲基化轉移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)的表達介導對Smad7表觀遺傳的抑制，從而促進TGF-β介導的纖維化[30]。肝纖維化時，Smad2、Smad3被強烈激活，并且Smad3是導致纖維化的關鍵因素。Smad4與Smad3相互作用并參與下游促纖維化靶基因的轉錄，而Smad7以兩種不同的方式負調控TGF-β/Smads信號。一種是Smad7與TβR-Ⅰ結合以阻止Smad2/3的磷酸化，另一種是Smad7將泛素連接酶E3、Smad泛素化調節因子招募到Smad2，TβR-Ⅰ泛素化并降解這兩種蛋白質[31]。Smads正負信號之間的不平衡可能在肝纖維化的發展中起著至關重要的作用。

大多抗纖維化藥物通過TGF-β/Smads信號通路發揮作用，例如，在肝纖維化大鼠模型中，厚樸酚可抑制TGF-β/Smads信號通路的活化，有效逆轉肝損傷；強效精準的第二代酪氨酸激酶抑制劑尼洛替尼可降低TGF-β1水平，抑制炎性因子的釋放，抑制四氯化碳誘導的肝纖維化，發揮潛在的抗纖維化作用[32-33]。此外，在人源及鼠源纖維化肝組織中，存在10-11易位蛋白3(ten-eleven translocation 3, Tet3)表達，Tet蛋白屬于一種新的DNA脫甲基酶，在癌癥的進展中發揮重要作用，但對其在肝纖維化中作用和機制知之甚少。Xu等[34]研究發現，Tet3和TGF-β1在肝細胞中存在正反饋，Tet3表達增加，促進TGF-β1的表達上調，誘導HSCs分化為MFB，抑制Tet3/TGF-β1信號通路可以減輕小鼠肝纖維化，證明Tet3和TGF-β1是肝纖維化的重要決定因素。因此，深入研究TGF-β/Smads信號通路上下游的調控機制有助于更好地研發靶向抗肝纖維化藥物。但由于TGF-β的生物學功能廣泛，目前發現的靶向藥物不良反應顯著，已超出了治療獲益， TGF-β及其信號通路在肝纖維化中的作用仍需更進一步深入研究。

2.3TGF-β及其信號通路與肝癌 TGF-β作為人體免疫系統的多功能調節者，可控制細胞和組織分化，并維持機體平衡，與肝癌的發生、發展密切相關[35]。肝癌的演變過程是一個多步驟進展的過程，大多數肝癌都發生在CHB或者肝硬化后。TGF-β及其信號通路在肝癌發生、發展的各個階段均發揮關鍵作用，在肝癌細胞和周圍腫瘤基質之間發揮直接介導作用。有研究發現，TGF-β1在肝癌組織中過表達[36]，與宋培軍等[37]研究結果一致。進一步研究表明，TGF-β1水平與肝癌進展和不良治療結果直接密切相關[38]。在肝癌發生早期，TGF-β可以對肝細胞的增殖、分化產生明顯抑制作用；在肝癌后期則顯著促進ECM的形成、EMT及腫瘤的惡性浸潤，TGF-β信號通路通過各種方式，如充當自分泌或旁分泌生長因子，誘導機體微環境發生改變，使之朝促進肝癌發展的方向進展[39]。TGF-β也會引起腫瘤細胞可塑性的改變，從而賦予移行性腫瘤起始細胞(tumor-initiating cell, TIC)的特性，進一步促進肝癌的發展[40-41]。TGF-β信號通過多種通路影響肝癌的發生、發展，其中最重要的信號通路是Smads通路。研究證實，在肝癌發生、發展的過程中，TGF-β在病程早期發揮抑制腫瘤進展作用，而到病程后期則轉變為促進惡性腫瘤細胞增殖、浸潤的作用，并由Smads通路介導[42]。

TGF-β生物學作用廣泛，其在肝癌中的生物學作用卻并不常見。要想有效利用肝組織中的TGF-β轉導途徑，需要更好地理解其在肝組織中的復雜作用，包括對不同類型肝細胞的多種作用。盡管TGF-β及其信號通路的作用尚未完全明確，但控制TGF-β及其信號通路仍被認為是一種延緩肝癌進展的好方法[43-44]。進一步深入研究TGF-β/Smads通路在肝癌治療中的作用及機制可為有效防治肝癌的早期發生及提高后續治療效果提供理論基礎。

2.4TGF-β及其信號通路與肝棘球蚴病 隨著對各種寄生蟲治療方法的不斷改進，華支睪吸蟲、肝片形吸蟲、肝毛細線蟲所引起的各種肝臟疾病的發病率已經明顯下降，相關的醫學報道相對較少。但是，我國西部地區棘球蚴病發病率仍較高，應引起關注。棘球蚴病多發于人的肝臟，其次為肺、腦、骨，未及時治療或長期治療不當的肝泡型棘球蚴患者10～15年死亡率高達90%，肝囊型棘球蚴病死亡率為2%～4%[45]。棘球蚴侵入中間宿主后，在包囊及一些棘球蟲體的黏液和分泌物聯合作用下，使機體的免疫功能發生一系列變化，并對免疫系統造成嚴重損害，逐漸形成一種病理性的免疫逃避機制。棘球蚴病的自體抗原既可含有感染蟲體、蟲體細胞表面的自身代謝抗原，也可含有少量來自于感染蟲體內部分泌物、排泄物、囊液的自身代謝抗原。這些免疫抗原可直接誘導人體宿主細胞產生各種免疫應答。

TGF-β在肝棘球蚴病的發生、發展中發揮重要作用[46]。TGF-β在肝泡型棘球蚴病變組織和器官中明顯升高，特別是在纖維化區域，提示TGF-β可能引起肝泡型棘球蚴患者組織器官的纖維化和ECM的過度沉積[47]。Wang等[48]采用Westernblot、qRT-PCR和免疫組織化學方法檢測肝泡型棘球蚴感染后第2～360天小鼠模型的TβR、下游Smads信號活化以及纖維化標記物的表達，結果顯示，在泡球蚴小鼠中TGF-β、TβR及其下游Smads在肝周浸潤和肝細胞內均有明顯表達，再次驗證TGF-β及其信號通路在肝泡型棘球蚴病中起著重要的免疫耐受和肝纖維化作用。Zhang等[49]研究證明，TGF-β的持續表達可能導致人自然殺傷細胞家族2成員D(natural-killer group 2 member D, NKG2D)的調節，進而抑制NKG2D依賴的細胞毒性。這種信號系統的異常可能是導致寄生蟲逃避宿主免疫的機制之一。肝囊型棘球蚴病發生于中間宿主，但通過抑制TGF-β信號減輕肝囊型棘球蚴病變相關肝損傷的作用仍有待于進一步研究。有研究發現，聯合應用TGF-β信號抑制劑和吡非尼酮可降低TGF-β信號通路相關蛋白的表達和膠原的生成[50]。說明TGF-β在減輕肝細胞衰老和恢復肝功能方面具有較高的潛力。目前關于肝棘球蚴病與TGF-β信號通路的研究不多，缺乏足夠的理論支持，進一步研究TGF-β信號通路或能成為肝棘球蚴病相關性肝纖維化的治療靶點。

3 小結

綜上，TGF-β及其信號通路在肝臟疾病發生、發展中起著至關重要的作用。由于TGF-β的生物學作用廣泛，已研發的藥品不良反應較大，進一步明確TGF-β及其信號通路在肝臟疾病中的具體作用機制，可篩選出與肝臟疾病相關的治療靶點，為肝臟疾病的進一步研究提供更多理論支持。