miR-224-3p靶向腫瘤壞死因子超家族成員14抑制脂質積累和動脈粥樣硬化的研究

陳泉潤，蔣玉芹，劉 鵬，謝蒂立

(1.電子科技大學醫學院，四川 成都610054；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院老年心血管科，四川 成都610072)

動脈粥樣硬化(AS)是一種以脂質穩態失調為特征的慢性血管炎癥性疾病[1]。在AS形成過程中，循環中的單核細胞到內膜后分化成巨噬細胞，巨噬細胞再攝取大量改性脂蛋白，如氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)后，轉化為富脂泡沫細胞，這是早期AS病變的標志[2]。miRNAs是長度約為22 bp的小型內源性非編碼RNA分子，充當轉錄后調節因子來調節靶基因的表達，從而介導細胞增殖、分化和代謝等生理病理過程[3,4]。Yébenes等[5]研究表明，抑制血管中miR-217可保護血管功能，緩解AS。Wang等[6]的研究表明，miR-224-3p在AS中低表達，miR-224-3p上調可減輕小鼠AS。腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員14(TNFSF14)在多種免疫細胞中高表達[7]。Yuan等[8]報道TNFSF14在冠心病患者中表達增加，并促進ox-LDL誘導的THP-1細胞的炎癥反應和脂質代謝。本課題擬通過研究miR224-3p和TNFSF14的相互作用及在老年AS患者、動物和細胞模型中的表達，確定其在AS中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1主要試劑和儀器 胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養基和12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波酯(PMA)和ox-LDL購自美國Sigma-Aldrich；所有miRNA相關試劑，對照模擬物(miR-NC)、miR-224-3p模擬物(miR-224-3p)、對照抑制劑(in NC)、miR-224-3p抑制劑(in miR-224-3p)及對照miRNA agomir(ago-NC)、miR-224-3p agomir(ago-miR-224-3p)、對照 antago-miRNA、antago-miR-30a-5p及過表達對照質粒(pcDNA)、過表達TNFSF14質粒(TNFSF14)和TNFSF14雙熒光素酶質粒均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Lipofectamine 3000試劑購自美國Invitrogen；TRIzol試劑、青霉素-鏈霉素、RIPA緩沖液、BCA蛋白質測定試劑盒和BeyoECL Plus購自上海碧云天公司；雙熒光素酶報告分析系統 (北京Promega)；cDNA反轉錄試劑盒購自德國Fermentas；SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒(大連寶生物公司)；一抗GAPDH、TNFSF14、清道夫受體(SR-A)、乙酰輔酶A乙酰轉移酶1(ACAT1 )、脂肪生成基因(ACS)、PPARα和CPT-1及相應二抗購自美國SantaCruz公司；甘油三酯(TG酶法)測試盒和總膽固醇(TCH酶法)測試盒購自南京建成生物工程研究所。ABI 7900HT 快速實時 PCR 系統(美國Applied Biosystems)；Tanon 5500凝膠成像系統(上海天能公司)；Olympus BX50倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)。

1.1.2臨床樣本 收集2019年6月至2020年6月在四川省人民醫院心血管內科確診的老年(年齡65～79歲)AS患者31例和健康志愿者18例血液標本(作為對照組)，用qRT-PCR和蛋白質免疫印跡的方法比較其中miR-224-3p和TNFSF14表達水平的變化。該研究得到了本院倫理委員會的批準，參與者已全部簽署知情同意書。

1.1.3實驗動物 30只8周齡雄性ApoE -/- 背景的C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SCXK(京)2021-0011，并在12 h光照/黑暗循環下飼養在無菌環境中，可以自由獲取食物和水，保持恒定的濕度 (55±5)% 和溫度 (23±1)℃。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與處理 THP-1單核細胞(TIB-202，ATCC)在補充有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養基中于37 ℃和5% CO2的加濕環境下培養。為了誘導單核細胞分化為巨噬細胞，用100 nmol/LPMA處理細胞24 h。然后，將巨噬細胞與50 μg/ml ox-LDL孵育48 h，形成泡沫細胞。根據制造商的方案，使用Lipofectamine 3000 試劑將上述相關試劑轉染至THP-1細胞，分別為miR-NC組、miR-224-3p組、in NC組、in miR-224-3p組、pcDNA組和TNFSF14組，對照組不進行轉染，以驗證轉染效率及miR-224-3p和TNFSF14的靶向關系；隨后分組為對照組、ox-LDL組、ox-LDL+miR-224-3p組、ox-LDL+TNFSF14組和ox-LDL+TNFSF14+miR-224-3p組，以檢測過表達miR-224-3p和TNFSF14對ox-LDL處理的THP-1細胞中脂質代謝的影響。

1.2.2qRT-PCR檢測基因表達 使用TRIzol 試劑從THP-1細胞中分離總RNA。使用cDNA反轉錄試劑盒將來自每個樣品的約5 μg總RNA逆轉錄為第一鏈cDNA。然后，以cDNA為模板，使用SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒進行實時PCR反應，程序為95 ℃ 3 min；90 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。使用2 -ΔΔCt方法計算相對表達量。引物序列如下：miR-224-3p 正向引物：5′-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3′，反向引物：5′-AAGCTTGCATCACCAGAGAACG-3′；U6 正向引物：5′-CTGGTAGGGTGCTCGCTTCGGCAG-3′，反向引物：5′-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′；TNFSF14正向引物: 5′-CGTGAGACCTTCGCTCTTGTAT-3′，反向引物: 5′-CCCTCAGTGTTTGTGGTGGAT-3′；GAPDH正向引物: 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3′。反向引物: 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′

1.2.3蛋白質免疫印跡 將細胞或小鼠主動脈組織用RIPA緩沖液進行裂解。使用BCA蛋白質測定試劑盒進行蛋白質濃度定量。隨后，取等量蛋白質通過 SDS-PAGE電泳分離并轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后用相應抗體在4 ℃避光孵育過夜。然后，將膜與HRP標記的二抗在37 ℃孵育1 h。使用BeyoECL Plus觀察蛋白質條帶，使用Image J軟件確定光密度值。

1.2.4雙熒光素酶報告基因分析 在線數據庫TargetScan(http://www.targetscan.org/)預測miR-224-3p與TNFSF14之間的結合位點。THP-1細胞以每孔1×104個的密度接種在96孔板中。將TNFSF14 3′UTR WT或TNFSF14 3′UTR MUT和 miR-224-3p模擬物或miR-NC通過Lipofectamine 3000試劑共轉染至THP-1細胞，48 h后使用雙熒光素酶報告分析系統評估相對熒光素酶活性。

1.2.5油紅O染色細胞 內脂滴經體外轉染48 h后，THP-1細胞衍生的泡沫細胞在4%多聚甲醛溶液中固定5 min，然后用油紅O工作溶液在37 ℃ 避光染色5 min，并用60%異丙醇脫色10 s。在倒置顯微鏡下(×200)對染色的細胞進行拍照。

1.2.6細胞內TG和TC檢測 按照甘油三酯(TG酶法)測試盒和總膽固醇(TCH酶法)測試盒說明書操作測定THP-1細胞內TG和TC水平。

1.2.7動物實驗[9]將小鼠隨機分為HFD組、HFD+ago-NC組和HFD+ago-miR-224-3p組，每組10只。給予小鼠高脂飲食(HFD)(18%脂肪和1.25%膽固醇)12周以誘導AS，同時通過尾靜脈分別注射PBS、ago-NC、ago-miR-224-3p，每3天一次。

1.2.8組織取材 12周后，小鼠禁食過夜并在清晨通過腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉。摘除眼球，取血后離心分離血清，-80 ℃保存。使用相應的試劑盒檢測血清中TC和TG水平。然后打開胸腹腔，4%多聚甲醛灌流左心室30 min，仔細解剖心臟上部和近端主動脈，將主動脈縱向展開，用油紅O染色，然后拍照，用Image-Pro Plus 7.0軟件測定主動脈表面被油紅O染色的病灶面積百分比。隨后，提取小鼠主動脈總RNA，按照1.2.2 qRT-PCR操作檢測基因表達。

1.2.9HE染色顯示主動脈竇病變情況 取各組小鼠主動脈竇處組織樣本，用O.C.T包埋劑包埋，石蠟切片脫蠟脫水后，蘇木素染色5 min，再將玻片置于伊紅染液中染色2 min，流水沖洗。常規脫水，透明，封片。光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.10油紅O染色主動脈竇 主動脈竇組織經冰凍切片后，油紅O染色10 min，50%異丙醇分化30 s，蘇木素復染5 min，1%鹽酸酒精分色1s，封片后光鏡下觀察并拍照。用Image-pro Plus 7.0軟件檢測主動脈竇油紅O染色面積。

1.2.11Masson染色主動脈竇 組織經冰凍切片后，蘇木素染色6 min，氨水返藍，麗春紅品紅染色液染色3 min，磷鉬酸分化3 min，苯胺藍染色2 min，分化水洗，脫水，透明，封片。鏡下觀察并拍照。膠原纖維染成藍色，肌組織染成紅色。

1.3 統計學方法使用 GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析，所有數據均表示為3次獨立實驗的平均值±標準差。通過未配對的Student′st檢驗比較兩組之間的差異，單因素方差分析用于比較多組之間的差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-224-3p和TNFSF14在體內和體外的表達與對照組(1.00 ± 0.02)比較，miR-224-3p在AS患者血清(0.41 ± 0.03)和ox-LDL誘導的THP-1細胞中(0.38 ± 0.04)的表達顯著降低(P<0.05)，TNFSF14蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-224-3p和TNFSF14在體內和體外的表達 a：蛋白質免疫印跡檢測血清中TNFSF14蛋白的表達；b：蛋白質免疫印跡檢測THP-1細胞中TNFSF14蛋白的表達

2.2 miR224-3p與TNFSF14的靶向關系TargetScan數據庫分析發現miR-224-3p與TNFSF14的3′UTR序列結合(圖2)。TNFSF14 3′UTR WT與miR-224-3p共轉染至THP-1細胞明顯降低相對熒光活性(P<0.05)，見表1。與對照組相比，miR-224-3p組TNFSF14蛋白表達下調，inmiR-224-3p組TNFSF14蛋白表達上調(P<0.05)。見表2。

圖2 TargetScan數據庫分析miR-224-3p與TNFSF14結合的序列

表1 熒光素酶活性實驗驗證miR-224-3p和TNFSF14的靶向關系

表2 各組THP-1細胞中miR-224-3p和TNFSF14表達水平的變化

2.3 過表達miR-224-3p和TNFSF14后THP-1細胞中脂質含量和脂質代謝相關蛋白表達的變化對照組、pcDNA組和TNFSF14組中TNFSF14 mRNA的相對表達量分別為(1.00 ± 0.04)、(0.97± 0.06)和(4.32 ± 0.27)，與對照組相比，TNFSF14組TNFSF14 mRNA表達顯著上調(P<0.05)。與對照組相比，ox-LDL刺激后細胞內脂質積累顯著增多；與ox-LDL組比較，ox-LDL+TNFSF14組細胞內脂脂質積累顯著增多，而ox-LDL+miR-224-3p組細胞內脂質積累明顯減少，見圖3和表3。 ox-LDL組細胞中SR-A、ACAT1和ACS的表達較對照組顯著上調(P<0.05)，PPARα和CPT-1的表達顯著下調；與ox-LDL組比較，ox-LDL+TNFSF14組細胞中SR-A、ACAT1和ACS的表達顯著上調(P<0.05)，PPARα和CPT-1的表達顯著下調(P<0.05)，ox-LDL+miR-224-3p組細胞中各蛋白表達情況與之相反。 與ox-LDL+TNFSF14組比較，ox-LDL+TNFSF14+miR-224-3p組細胞內脂質積累顯著減少(P<0.05)，SR-A、ACAT1和ACS的表達顯著下調(P<0.05)，PPARα和CPT-1的表達顯著上調(P<0.05)。見表4。

圖3 THP-1細胞中脂質累積圖像 a：對照組；b：ox-LDL組；c：ox-LDL+miR-224-3p組；d：ox-LDL+TNFSF14組；e：ox-LDL+TNFSF14+miR-224-3p組(油紅O染色，×200)

表3 各組THP-1細胞中的TC和TG含量變化

2.4 過表達miR-224-3p對ApoE-/-小鼠中脂質代謝相關蛋白表達的影響HFD組、HFD+ago-NC組、HFD+ago-miR-224-3p組小鼠主動脈中miR-224-3p表達量分別為(1.00 ± 0.03)、(0.98 ± 0.05)和(3.73 ± 0.18)，TNFSF14蛋白表達量分別為(0.54 ± 0.04)、(0.51 ± 0.06)和(0.22 ± 0.03)。與HFD組相比，HFD+miR-224-3p組小鼠主動脈中miR-224-3p的表達顯著增加，TNFSF14蛋白表達顯著下降(P<0.05，圖4a)，TC和TG水平顯著降低(P<0.05)，見表5。SR-A、ACAT1和ACS的表達明顯下調，PPARα和CPT-1的表達顯著上調(P<0.05)，見圖4b。

表4 各組THP-1細胞中脂質代謝相關蛋白水平變化的比較

2.5 過表達miR-224-3p對ApoE-/-小鼠AS的影響與HFD組相比，HFD+ago-miR-224-3p組主動脈弓區域AS病變的數量、大小以及病變面積明顯減少(P<0.05)。HE、油紅O和Masson染色顯示HFD+ago-miR-224-3p組病灶面積及脂質沉積顯著減少，膠原蛋白含量顯著增加(P<0.05)。見表6和圖5。

表5 各組小鼠血清中TC和TG的含量變化

圖4 過表達miR-224-3p對ApoE-/-小鼠中脂質代謝相關蛋白表達的影響a：蛋白質印跡檢測TNFSF14蛋白表達；b：蛋白質印跡檢測脂質代謝相關蛋白的表達(1：HFD組；2：HFD+ago-NC組；3.HFD+ago-miR-224-3p組)

表6 各組ApoE-/-小鼠AS病變比較

圖5 過表達miR-224-3p對ApoE-/-小鼠AS的影響a：HFD喂養的Apo E -/-小鼠通過尾靜脈注射PBS、ago-NC和ago-miR-224-3p處理后，立體顯微鏡下主動脈弓斑塊(黃色箭頭)(40×)；b：Apo E -/-小鼠主動脈大體標本(油紅O染色)；c：Apo E -/-小鼠主動脈根部冷凍切片(HE、油紅O或Masson染色(1：HFD組；2：HFD+ago-NC組；3.HFD+ago-miR-224-3p組)

3 討論

最近的研究表明miR-224-3p在人類心血管疾病中發揮重要作用。例如，Dharma等[10]發現miR-224-3p與STEMI患者血管生成后冠脈微血管阻塞有關。Wang等[6]報道HDAC1通過去乙酰化增強miR-224-3p的表達，進而減少內皮細胞凋亡，產生抗AS作用。本研究觀察到在AS患者中，miR-244-3p低表達，而TNFSF14高表達。THP-1細胞已被廣泛用于脂質代謝相關的研究[11]。本研究結果顯示在ox-LDL誘導的THP-1巨噬細胞中miR-244-3p 和TNFSF14表達結果與體內一致。miR-244-3p直接與TNFSF14 3′UTR結合來抑制TNFSF14的表達。

研究表明巨噬細胞在炎癥和脂質沉積中起著關鍵作用，而炎癥和脂質沉積是AS斑塊形成和破裂的關鍵觸發因素[12,13]。本研究結果顯示，TNFSF14過表達顯著增加了ox-LDL誘導的THP-1巨噬細胞內的脂滴，升高了細胞內TC和TG水平，并顯著降低了脂肪分解基因的水平，增加了脂肪生成基因的表達。重要的是，miR-224-3p通過負性調節TNFSF14的表達減輕了巨噬細胞中的脂質積聚。富含膽固醇的脂蛋白(包括ox-LDL)主要通過細胞表面的如SR-A1被攝取到THP-1巨噬細胞中，并在泡沫細胞的形成中起重要作用[14]。ACAT-1是細胞膽固醇穩態和AS的關鍵酶[15]。

本研究發現miR-224-3p在高脂飲食喂養ApoE敲除小鼠體內明顯下調TNFSF14的表達，并降低了血清TC和TG含量，同時顯著增加了脂肪分解基因的水平，降低了脂肪生成基因的表達，與細胞培養實驗結果一致。此外，HE、油紅O和Masson染色顯示miR-224-3p顯著減少病灶面積并抑制脂質沉積，并顯著增加膠原蛋白含量。因此，miR-224-3p通過降低TNFSF14的表達抑制脂質積聚，進而抑制ApoE敲除小鼠AS病變的發展。