喀斯特煤礦區土地利用類型對土壤養分、酶活性及化學計量特征的影響

夏國棟 朱四喜* 李武江 趙 偉 高 寧 趙 斌

(1.貴州民族大學 生態環境工程學院，貴陽 550025；2.國家民委喀斯特環境地質災害防治重點實驗室(貴州民族大學)，貴陽 550025；3.貴州民族大學 人文科技學院，貴陽 550025)

礦產資源開發可以促進社會經濟發展，但是開發活動所產生的酸性廢水會通過沉降、地表徑流等方式對周圍土壤、水體、大氣造成污染[1]。礦區土壤成為最大的重金屬污染受納地，嚴重影響了生態平衡，危害人類身體健康，所以生態修復顯得尤為重要[2-3]。目前礦區土壤的恢復主要表現在土壤養分和酶活性方面[4-5]。土壤養分和酶活性直接反應了土壤生態系統的完整性[6]，通常可以通過土壤酶活性的高低來判斷土壤生物性的強弱從而判斷該土壤的質量[7-10]，采礦活動會對土壤酶活性造成嚴重影響[11]。

土壤中一切化學反應都是依靠土壤酶所進行的，土壤酶與土壤養分之間的相互作用是判斷土壤肥力的重要手段[12]。有研究表明酸性磷酸酶(ACP)能夠促進脫磷速度，反映土壤中磷元素的形態轉換[13]；而β-1，4-葡糖苷酶(BG)、β-1，4-木糖苷酶(BX)、纖維素二糖水解酶(CBH)、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)在一定程度上也可以反映土壤碳氮磷的生物循環特征[14-15]，這些是土壤肥力的關鍵酶類，BG、BX、CBH影響了土壤有機質的分解；NAG、LAP與微生物的協同作用使土壤釋放出碳、氮、磷等元素，提高有機質的降解速率，促進氮磷循環[16]。李武江等[17]發現，研究區重金屬Cu、Ni、Zn超標較為嚴重，均超過貴州土壤重金屬背景值，且礦山周邊的農田重金屬富集嚴重。

貴州省是我國典型的喀斯特高原山區，貴州省喀斯特地區存在水土流失、土壤易被腐蝕等問題。有研究表明全省有90%左右的耕地分布在喀斯特山區中[18]。喀斯特山區由于獨特的地理條件，導致重金屬污染遷移性強并且污染面源廣，具有潛在的高生態風險性等特點[19-20]。目前，國內學者對西南喀斯特地區六盤水礦區土壤以及對礦區周邊土壤酶活性和養分之間相互影響的研究較少。本研究以貴州六盤水某礦區周邊不同土地利用類型土壤為研究對象，測定土壤養分與酶活性，分析喀斯特地區煤礦區不同土地利用類型對土壤養分、酶活性的影響；土壤養分和酶活性之間的影響規律，結合酶化學計量分析的方法，為礦區周圍生態環境治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年9月對位于貴州省六盤水市西北部，距離市中心20 km左右，海拔在1 650～2 200 m的礦區進行實地考察后將研究區根據不同土地利用類型分成耕地(G1G)、林地(G1L)、植物復墾區(G1Z)、居民區(JD)四個區域進行采樣。采樣點以50 m×50 m為一個樣品單元，每個樣品單元采用對角線法(即四角和中心點)，共5個土壤樣品混勻后即為該樣點的混合樣品。4個采樣區域采取兩個深度a(0～20 cm)、b(20～40 cm)。用于測定土壤酶活性的樣品采集后立即放入裝有干冰的保溫箱保溫，之后帶回實驗室放入冰箱冷藏。用于測定土壤養分的樣品放于自封袋，帶回實驗室后等待自然風干用于檢測。

1.2 土壤養分的測定

土壤養分的測定參照《土壤農業化學分析方法》：測定土壤pH值(電位法)、有機質(SOM，重鉻酸鉀-濃硫酸氧化-外加熱法)、全氮(TN，硫酸消煮-水楊酸鈉法)、全磷(TP，硫酸消煮-鉬銻抗法)、有效磷(AP，磷鉬藍法)、硝態氮(NO3-—N，硫酸肼還原法)、銨態氮(NH4+—N，水楊酸鈉法)等理化指標。

1.3 土壤酶活性的測定

本研究共測定磷酸酶、β-1，4-葡糖苷酶(BG)、β-1，4-木糖苷酶(BX)、纖維素二糖水解酶(CBH)、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)6種土壤水解酶，6種水解酶詳細情況見表1。使用多功能酶標儀(SynergyH1，BioTek)進行熒光測定，在365 nm波長處激發，在450 nm處檢測熒光。酶活性的單位為μmol/gh。

表1 礦區不同土地利用類型土壤養分含量

1.4 數據處理

用土壤酶化學計量分析，其計算公式如下[21]：

矢量角度=arctan2(X,Y)

上式中，矢量長度代表養分所受到能量的限制作用，而矢量角度則代表氮元素受到磷元素的約束作用，當矢量角度>45°代表磷限制，反之則代表氮限制。

本文數據采用Excel軟件對原始數據進行初步整理，使用SPSS軟件中單因素方差分析(One Anovn)和Duncand分別對土壤養分、酶活性及化學計量特征進行分析。采用聯川生物云平臺作土壤養分與酶活性之間的相關性分析。利用Canoco5軟件中的冗余分析(RDA)來探索化學計量比與土壤養分之間的關系。采用Graphpad prism9.0軟件作圖，統計顯著性水平p=0.05，冗余分析(RDA)則采用Canoco5作圖，且表中數據表現形式為：均值±標準誤差。

2 結果與分析

2.1 不同土地利用類型對土壤養分的影響

由表1可知，礦區周邊土地不同利用類型土壤的pH值范圍為5.66～7.29，耕地土壤酸堿度表現為中性；林地土壤偏酸性且深層土壤偏酸性更為明顯；復墾區表層土壤比深層土壤的酸性更強，居民區土壤則表現為深層土壤酸性強于表層。各區域土壤的全氮、全磷、有效磷、有機質在不同土地利用類型下的不同土壤深度里的含量都有相同的規律，即表層含量均大于深層含量。其中，土壤的全氮、有效磷在土壤表層和深層的差異較明顯。速效磷含量在耕地土壤中含量較高，而在植物復墾區土壤中含量相對低一些。有機質在植物復墾區的土壤中含量較高，耕地次之，林地相對較低。銨態氮、硝態氮含量均表現為耕地較高，居民區次之，植物復墾區最低。

2.2 礦區不同土地利用類型對酶活性的影響

圖1是亮氨酸氨基肽酶、磷酸酶、β-1，4-木糖苷酶、β-1，4-葡糖苷酶、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶、纖維素二糖水解酶分別在礦區不同土地利用類型的含量特征，植物復墾區的酶活性都顯著低于其他土壤區。亮氨酸氨基肽酶在林地和居民區土壤中的活性較高，且表現為表層土壤>深層土壤，而在植物復墾區的活性相對較低，明顯低于20 μmol/gh。磷酸酶在居民區的活性相對較高，其表層土壤酶活性明顯高于深層土壤酶活性，而在耕地、林地和復墾區表現為深層土壤酶活性高于表層土壤，可能是因為表層土壤受污染較為嚴重從而對磷酸酶活性有抑制作用，明顯低于20 μmol/gh，β-1，4-木糖苷酶、β-1，4-葡糖苷酶均表現為在居民區土壤的酶活性較高，在復墾區土壤的酶活性相對較低，且在耕地土壤中表現為表層土壤酶活性<深層土壤酶活性，而在林地和居民區表層土壤酶活性>深層土壤酶活性。根據李武江等[17]的研究，耕地表層土壤中酶活性受到抑制可能是由于重金屬富集造成的。而在林地土壤中，養分較高的表層土壤酶活性高于養分相對低的深層土壤酶活性。此外，β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶和纖維素酶的酶活性在林地和居民區較高，其次耕地>復墾區，纖維素酶在耕地土壤中表現為表層土壤酶活性>深層土壤酶活性。整體來看，酶活性在植物復墾區土壤中最低，在其他土地利用類型中的排序為：林地、居民區>林地>耕地。

圖1 不同植被演替階段土壤酶活性Figure 1 Soil enzyme activity at different vegetative succession stages.注：不同小寫字母表示同一種酶在不同演替階段間顯著差異(p<0.05)。圖中(a)為亮氨酸氨基肽酶，(b)為磷酸酶，(c)為β-1，4-木糖苷酶，(d)為β-1，4-葡糖苷酶，(e)為β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶，(f)為纖維素二糖水解酶

2.3 不同土地利用類型土壤酶活性與土壤養分的相關性

土壤酶容易受土壤養分的影響，在土壤中變化非常敏感，常作為反映土壤養分高低的指標[22-24]。從圖2中可以看出硝態氮與β-1，4-葡糖苷酶、β-1，4-木糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶呈顯著正相關，而與磷酸酶呈負相關。有機質與亮氨酸氨基肽酶、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶顯著正相關，而與磷酸酶呈顯著負相關。表明有機質能夠促進亮氨酸氨基肽酶、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶的生長，而高有機質的環境會抑制磷酸酶的滋生。pH值與纖維素二糖水解酶、β-1，4-葡糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶呈正相關，而與磷酸酶呈弱負相關。表明纖維素二糖水解酶、β-1，4-葡糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶在偏堿性的土壤環境更能生長，而磷酸酶更能生長于偏酸性的環境。全磷與磷酸酶、β-1，4-葡糖苷酶、纖維素二糖水解酶呈正相關，則表明磷酸酶的活性與磷元素的含量密切相關。而全氮與β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶、磷酸酶、β-1，4-木糖苷酶呈負相關，碳氮比與亮氨酸氨基肽酶、β-1，4-木糖苷酶、纖維素二糖水解酶呈顯著正相關，而與磷酸酶呈負相關。為了深入研究土壤養分與酶活性之間的相關性程度，所以作出圖3。

圖2 礦山不同土地利用類型土壤養分與土壤酶活性的相關性網絡圖Figure 2 Correlation network diagram of soil nutrients and soil enzyme activities in different land use types of mines.

從圖3中可以更直觀地表現出土壤養分和所測酶的相關性程度。土壤硝態氮、碳氮比以及有機質除了與酸性磷酸酶呈現負相關外與其余所測土壤酶呈現正相關，相關性差異較大。硝態氮與β-1，4-木糖苷酶、β-1，4-葡糖苷酶和纖維素二糖水解酶的相關性顯著，其中與β-1，4-木糖苷酶的相關性最強。有機質與亮氨酸氨基肽酶呈具有顯著相關性，其相關性>0.4，并且與β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶也具有顯著相關性。有機質與酸性磷酸酶呈顯著的負相關關系，相關系數在0.3～0.4。含水率能嚴重抑制亮氨酸氨基肽酶的活性，除了酸性磷酸酶外，含水率對所測其他酶均有一定的抑制作用。總氮、氨態氮與所測酶相關性差異不顯著，相關系數較小。總磷與速效磷與酸性磷酸酶呈現正相關，相關系數在0.2～0.4。速效磷能有效的促進β-1，4-葡糖苷酶和纖維素二糖水解酶活性的增加。pH值與酸性磷酸酶、β-1，4-葡糖苷酶、β-1，4-木糖苷酶、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶的相關性不顯著。

圖3 礦山不同土地利用類型土壤養分與土壤酶活性的相關性熱圖Figure 3 Correlation heat map of soil nutrients and soil enzyme activities in different land use types of mines.

2.4 礦區不同土地利用類型土壤酶化學計量和矢量特征

表2是不同土地利用類型不同深度土壤胞外酶化學計量比和矢量特征表，表層土壤酶C∶N表現為居民區>林地>耕地>復墾區，深層土壤耕地與林地酶C∶N顯著高于復墾區。酶C∶P表現為林地最高，復墾區最低，各土地利用類型的酶C∶P之間的差異不顯著。酶N∶P在各土地利用類型中的范圍在0.121～1.884，除了林地外，其他土地利用類型的酶N∶P均顯著小于耕地。酶活性矢量長度介于0.018～0.120，矢量角度除了復墾區外其余土地利用類型均小于45°，研究表明，復墾區土壤受磷限制，其余土地利用類型受氮限制。不同土地利用類型C∶N、C∶P、N∶P的平均值為0.544、0.671、1.224，而矢量長度與矢量角度的平均值為0.064°和33.388°。通過公式lnU(BG+BX+CBH)∶lnU(NAG+LAP)∶lnU(ACP)得出不同土地利用類型中平均土壤酶化學計量比為C∶N∶P=1∶1.838∶1.502。

表2 礦區不同土地利用類型土壤酶活性的化學計量和矢量特征

圖4為土壤酶活性計量比與土壤理化性質關系的冗余分析，結果顯示兩個排序軸分別解釋了變異的54.40%(RDA1)與9.07%(RDA2)，共解釋了變異的63.47%。有機質、全氮、C∶N對土壤酶N∶P具有顯著的影響，而與酶C∶P有顯著影響的是速效磷與硝態氮，速效磷、氨態氮與硝態氮對土壤酶C∶N有著正相關的關系。從圖中可以看出RDA第一軸與全磷關系密切而RDA第二軸則與硝態氮、氨態氮關系密切，并且沿RDA1增大的方向全磷增加，酶C∶N、酶C∶P、酶N∶P減小。

圖4 土壤酶活性計量比與土壤土壤養分的冗余分析Figure 4 Analysis of soil enzyme activity ratio and soil nutrient redundancy.

3 討論

3.1 不同土地利用類型對土壤養分的影響

土壤養分含量在不同土地利用類型下的土壤中存在顯著差異，這可能與受采礦活動對土壤的干擾程度及各區域的環境差異有關[25-26]，并且根據何淑勤等[27]的研究，土地利用類型的不同會導致土壤團聚體粒徑以及穩定性的改變，土壤團聚體起到調控土壤養分循環的作用[28]，從而導致土壤養分在不同土地利用類型中存在顯著性差異。在礦區的不同土地利用類型的土壤多偏中性和酸性，這也與段紹彥等[26]對礦區周邊坡地、耕地土壤基礎養分研究相似。研究發現林地與植物復墾區土壤養分較高，這是由于林地與植物復墾區自然植被分布密集，其根系與土壤接觸面積較大，所以粘結土壤能力強，提高了有機質以及氮元素的積累[29]。本研究發現耕地土壤養分較低，這可能與農事活動與施肥有關[30]，而有研究表明，農業耕地土壤由于農業活動的原因，會使得土壤團聚體的平均重量直徑(MWD)和幾何平均直徑(GMD)較低，從而影響土壤養分[31]。不同土壤深度中全氮、全磷、有效磷、有機質的含量均表現為土壤表層含量高于深層含量。耕地土壤的表層pH值略高于深層，這與莫愛等[32]對山地煤礦土壤的研究結果一致，礦區的其他區域土壤相對于其耕地土壤更顯酸性。

3.2 不同土地利用類型對酶活性的影響

土壤酶是表征土壤肥力的重要指標之一[21]，作為生態系統中的天然工具，土壤酶直接參與了土壤物質循環、養分積累，并間接影響了土壤生態系統的穩定性[33]。根據張孝存等[34]的研究，土壤酶的分布會隨著產酶生物以及生境理化性質在時空上的改變而發生改變，土壤養分在礦區不同土地利用類型的不同深度中土壤酶活性均表現為復墾區數值最低，其原因在于耕地、林地土壤養分充足且肥力高，而復墾區土壤有機質含量高但肥力較低，所以酶活性較低導致分解有機質的能力降低[35]。居民區土壤酶活性具有較明顯的“表聚性”，可能是表層土壤受到周邊居民生活的影響，居民生產活動會產生大量包含氮磷元素的物質，使得生物活躍性增強。而在其他區域土壤的酶活性“表聚性”不明顯，其原因為表層土壤受到嚴重重金屬污染從而抑制酶活性，這與盧怡等[36]對礦區土壤酶活性的研究結果類似。

3.3 土壤養分對酶活性的影響

土壤酶活性和土壤養分雙方都起到相互影響的作用[37]。研究發現，對酶活性變化起驅動作用的土壤養分有：pH值、硝態氮、銨態氮、有機質、全磷、有效磷、含量水、C∶N等[38]。研究表明土壤pH值與纖維素二糖水解酶(CBH)、β-1，4-葡糖苷酶(BG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)呈正相關趨勢，反映出CBH、LAP在堿性土壤中能有利于生物生長。研究發現碳氮比與LAP、β-1，4-木糖苷酶(BX)、CBH呈顯著正相關，說明LAP、BX、CBH受C、N 的影響大。土壤全磷與酸性磷酸酶(ACP)、BG、CBH呈正相關，表明ACP的活性與磷元素的含量密切相關。有機質對酶活性有較顯著的影響，有機質與LAP、β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶(NAG)顯著正相關結果表明了不同生境下土壤養分的不同對酶活性具有顯著的影響，根據孫毅等[33]的研究，酶活性的差異可能由不同土地利用類型土壤、氣候、微生物群落變化以及植被的不同所決定的。

3.4 土壤養分對土壤酶化學計量比的影響

根據SINSABAUGH等的研究，全球生態系統化學酶計量比為C∶N∶P=1∶1∶1[39]，而本文C∶N∶P=1∶1.838∶1.502，高于全球水平。通過研究，發現研究區域各土地利用類型土壤具有較高的N、P轉化酶活性，N、P元素在煤礦區土壤中較為缺乏，這樣的結果也與劉立斌等[40]的研究一致，表明喀斯特地區土壤養分比較貧瘠，發現同為貴州喀斯特地區，土壤氮、磷代謝酶活性很高，土壤受氮磷元素制約。根據STERNER等[41]的研究，產酶生物可以根據不同生境的需要，對酶合成中的資源進行調配，從而增加或者降低C∶N∶P等元素的不平衡。根據資源分配理論[41]，在本研究區，當土壤中有機質、碳源比較充足時，產酶生物會偏向于增加N、P獲取酶的分配，減少對C獲取酶的分配。矢量角度除復墾區外其余土地利用類型均小于45°，表明復墾區土壤受氮限制，其他土地利用類型土壤受氮元素限制。在本研究中，化學酶計量比主要受到土壤理化性質的影響，研究也與孫毅等[33]的研究類似，而土地利用類型對土壤酶化學計量比的影響可能也與土壤碳氮磷的變化息息相關[42]。從RDA分析中看出有機質和化學酶N∶P和C∶P呈現正相關的關系，與C∶N呈現負相關的關系，從而得出有機質與氮磷相關代謝酶(NAG、LAP、ACP)關系密切，而pH值與土壤酶均呈現負相關的關系，酶C∶P、酶C∶N與C∶N呈現正相關的關系，這也表明碳相關代謝酶(BG、CBH、BX)與C∶N相關，以上研究表明土壤養分和土壤酶之間具有一定程度的趨向性，有機質與pH值同時調控土壤酶活性。

4 結論

1)該煤礦區土壤多顯酸性，可以采用土壤調理劑來進行改良。土壤養分在礦區不同土地利用類型中表現為：林地、耕地土壤養分均較高，在復墾區土壤養分較低。含水率、全氮、全磷在耕地土壤中較為豐富，有機質在植物復墾區的含量相對較高。礦區土壤的不同深度中全氮、全磷、有效磷、有機質的含量均表現為土壤表層含量高于深層含量。在土壤表層與深層中，有機質的含量分布不均，可以通過種植綠肥提高微生物種類多樣性來增加微生物數量，從而提高土壤肥力。

2)土壤酶活性在該煤礦區不同土地利用類型下的土壤中存在明顯差異。所測酶在居民區和林地均表現出了較高的活性，而植物復墾區土壤酶活性最低。當前可以通過翻壓綠肥的手段來活躍土壤生物過程從而提高土壤酶活性。各種酶活性的高低為：亮氨酸氨基肽酶>磷酸酶>β-1，4-葡糖苷酶>β-1，4-乙酰-葡糖胺糖苷酶>β-1，4-木糖苷酶>纖維素二糖水解酶。所測酶在林地、居民區、復墾區土壤下不同深度的含量均顯示為表層土壤>深層土壤。

3)在土壤養分對土壤酶的相關性研究中發現，導致土壤酶活性受到抑制的原因是煤礦區土壤養分低和受到重金屬污染。其中C∶N、有機質、硝態氮、銨態氮與酶活性均呈顯著正相關，硝態氮可以很大程度促進酶活性的增加，氮源是有效驅動酶活性的主要因素之一。因此在土壤修復的過程中需要注意無機氮肥尤其是硝態氮肥的補充。有機質與化學酶計量比呈顯著正相關，pH值呈現負相關，這也表明酶活性的高低受土壤養分影響，同時也受到pH值的調控。

4)表層土壤酶C∶N表現為居民區>林地>耕地>復墾區，深層土壤耕地與林地酶C∶N顯著高于復墾區。酶C∶P表現為林地最高，復墾區最低，各土地利用類型的酶C∶P之間的差異不顯著。不同土地利用類型土壤具有較高的N、P轉化酶活性，N、P元素在煤礦區土壤中較為缺乏，復墾區土壤受磷限制，其余土地利用類型受氮限制。