應用馬鈴薯病原菌芯片法檢測馬鈴薯主要病毒試驗及結果分析

逯春杏，曹春梅*，王曉嬌，許 飛，邢曉東，張志成

（1.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古呼和浩特 010031；2.內蒙古自治區農畜產品質量安全中心，內蒙古呼和浩特 010010；3.烏蘭察布市農林科學研究所，內蒙古烏蘭察布 012000）

0 引言

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）屬于一年生茄科茄屬作物，一直以來在全世界的國家廣泛種植。2016年2月23日，我國農業農村部正式發布《關于推進馬鈴薯產業開發的指導意見》，意見指出將馬鈴薯作為主糧產品進行產業化開發，使得馬鈴薯成了繼稻米、小麥、玉米外的第四大主糧產業。近幾年來，我國的馬鈴薯產業發展速度越來越快，種植范圍越來越廣，但經濟收入卻不可觀。當前在馬鈴薯作物上發現的病毒、類病毒已多達40余種[1]，是馬鈴薯產量減少、品質下降、經濟收入低的重要因素。為了解決這一問題，需研究出一個高效快捷、靈敏度高、完整的、規范化的檢測技術體系。

傳統方法是根據病毒在寄主體內寄生后的生物學特性來鑒別，但隨著分子生物學的發展，現在多采用病毒的核酸、病毒蛋白的分子生物學鑒別方法，來提高病毒鑒定的準確性[2]。基因芯片以其高通量、高信息量且自動化程度高的特點成為檢測病毒核酸的最佳方法之一。生物芯片屬于分子生物檢測層級，擁有優越的靈敏度，它是利用檢體所提取出來的核酸RNA，經由核酸擴增儀（PCR）將其生物訊號放大到230倍，再利用專一性探針進行結合偵測，其靈敏度比傳統檢測方法（ELISA或是RT-PCR）高。其檢測樣本可選擇馬鈴薯組培組織、薯塊或葉片。

通常，在種薯生產上檢測的病毒包括[3]：馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus，PLRV）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯S病毒（potato virus S，PVS）、馬鈴薯A病毒（potato virus A，PVA）、馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）[4]。利用馬鈴薯病原菌芯片法不僅可以在簡短的時間內檢測出是否含有上述病毒病，還可以同時檢測PVY-N Type病毒、PMTV病毒以及4種細菌，即細菌性軟腐病（Ech）、軟腐黑脛（Pca、Pcc）、細菌性環腐（CMS）和細菌性青枯（RS），共計14種病毒病。該方法能有效避免因ELISA檢測中病毒空窗期所產生的漏檢之情形，準確把握馬鈴薯種薯質量，避免因遭受病毒或細菌感染造成的損失。

本研究利用馬鈴薯病原菌芯片檢測技術對內蒙古自治區農牧業科學院馬鈴薯研究中心保存的試管苗進行病毒檢測。研究結果可為馬鈴薯脫毒種薯生產過程中病毒檢測及防治提供理論依據，提高馬鈴薯病毒檢測水平，完善病毒檢測體系。

1 基本原理

檢測試劑適合各種檢測樣品，包含馬鈴薯組培苗、馬鈴薯塊莖與植株葉片等。針對馬鈴薯病毒中的核酸進行分子生物檢測，包括病原菌核酸提取（DNA/RNA Extraction）、核酸反轉錄聚合酵素連鎖反應（Reverse Transcription Polymerase China Reaction）以及核酸雜合反應（Hybridization），同時使用非放射性之化學呈色方法進行顯色。

2 特點

檢測靈敏度比傳統檢測方法（ELISA或RT-PCR）高效、快捷。但需要注意環境與儀器的清潔，防止試驗交叉感染。

3 材料與方法

3.1 試驗材料

材料來源于內蒙古自治區農牧業科學院馬鈴薯研究中心試驗室所保存的試管苗共計40份。

3.2 主要儀器和試劑

主要儀器包括雜合反應儀、震蕩混合機、PCR儀、影像掃描分析儀（選用）、離心機、洗板機（選用）、-18℃冷凍冰盒和移液槍。主要試劑：病原菌核酸提取試劑包括Rapid EB Ⅰ和Rapid EB Ⅱ。RT PCR試劑組包括：PVB-IV、Taq和RT。雜合反應試劑組包括：HA Buffer、B Buffer、Strep-AP、NBT/BCIP、C Buffer、Wash Buffer、Gene Top PVB-IV芯片、96孔盤膠膜和研磨袋。此試劑盒由巨合生物科技股份有限公司提供。試驗耗材（不包含在試劑盒中）：1.5 ml RNase-free離心管、拋棄式RNase-free吸管尖和RNasefree PCR操作管。

3.3 試驗方法

3.3.1 病原菌核酸的快速提取

取0.35 g馬鈴薯組織，加入EBI試劑500 μl，將組織用小錘充分研磨。取100 μl該組織液到0.2ml PCR操作管中。將樣品于PCR儀器中99℃加熱2 min，隨后在85℃下加熱13 min，最后保存于4℃。用小型離心機快速離心30 s，小心吸取10 μl上清液加入預先裝有240 μl EBII試劑的1.5 ml微量離心管中。利用試管震蕩機將液體混合均勻，再用離心機離心數秒，此時管中的液體即為檢測用的RNA樣品。

3.3.2 RT-PCT反應

按照樣品測定的數量來配制RT-PCR混合試劑，配制方法（表1）。將表中3種試劑利用震蕩機混合均勻，吸取10 μl分裝到各自PCR操作管中，最后在各PCR管中加入2 μl的樣品核酸。將裝好的所有PCR管放入PCR儀中，進行擴增處理。程序設置如下：a.45℃（30 min），94℃（2 min）；b.94℃（15 s），58℃（40 s），72℃（40 s），此過程循環30次；c.72℃（7min），8℃（∞）。

表1 RT-PCR混合試劑配制表

3.3.3 雜合反應

將RT-PCR產物在PCR反應儀中95℃加熱210 s，等反應儀降溫至4℃后，取出PCR管并置于冷凍保溫盒中備用。離心數秒，取HA Buffer 100 μl到生物芯片中，加入RT-PCR產物10 μl，最后貼上膠膜。將生物芯片盤放入雜合反應儀中，55℃，1000 rpm反應30 min。反應后，倒掉雜合反應液，加入200 μl Wash Buffer清洗2次，最后靜置1 min。倒掉Wash Buffer，并于吸水紙拍干。同時配制Blocking Reagent（表2）與Detection Reagent（表3），二者混合均勻將Detection Reagent避光存放，備用。

表2 Blocking Reagent配制表

表3 Detection Reagent配制表

取Blocking Reagent混合液100 μl加入生物芯片中。將生物芯片盤放入雜合反應儀中，55℃，1000 rpm反應5 min。反應后，倒掉反應液，用Wash Buffer 200 μl清洗1次，再次倒掉Wash Buffe。加入100μl C Buffer濕潤生物芯片，靜置1 min后倒掉并用吸水紙拍干。取Detection Reagent呈色混合液100 μl加入生物芯片盤中反應。隨后將反應盤放入雜合反應儀中，55℃，0 rpm反應7 min。反應完畢后，倒掉反應液，并用自來水大量沖洗反應盤。沖洗完畢后，在55℃條件下干燥，并且判讀結果。

4）生物芯片結果判讀。根據展示，進行直觀的結果判定（圖1）。

圖1 生物芯片結果判定對照

4 結果與分析

通過對40個馬鈴薯組培苗進行病原菌芯片檢測，結果顯示（表4、圖2），在40份樣品中，9份樣品為復合侵染，7份為單獨侵染，24份未檢測到病毒侵染。其中，2份樣品為PVY、PVS和PLRV的復合侵染，3份樣品為PVY和PLRV的復合侵染，1份樣品為PVM和PLRV的復合侵染，1份樣品為PVM、PVS的復合侵染，1份樣品為PVS和PLRV的復合侵染，1份樣品為PVS和PSTVd的復合侵染。7份單獨侵染的樣品中，1份樣品為PSTVd侵染，3份樣品為PLRV侵染，1份樣品為PVM侵染，1份樣品為PVY侵染，1份樣品為PVS侵染。

圖2 部分樣品檢測結果判讀

表4 馬鈴薯病毒檢測結果

表4 馬鈴薯病毒檢測結果（續表）

由此可見，無論復合侵染還是單獨侵染，馬鈴薯PLRV病毒侵染率較高。PVA、PVX、Ech、CMS、RS和PCS均未檢測到，說明PLRV可能是引起內蒙古地區馬鈴薯病毒病的主要病原之一，并且在馬鈴薯脫毒工作中較難脫除干凈。

5 結論

由于病毒的侵染，馬鈴薯通過塊莖無性繁殖并逐代增殖和加重是其退化的真正原因，同時也影響了馬鈴薯的產量與品質。因此，建立快捷高效的病毒檢測體系，加大對種薯質量把關的力度，真正實現種薯的全面脫毒，是提高種薯產量、發揮優良品種特性的重要手段之一[5]。

馬鈴薯病毒檢測技術主要有傳統生物學檢測技術、免疫學檢測技術和分子生物學檢測技術等。使用ELISA檢測[6]方法耗時較長，不能一次性檢測出兩種或兩種以上病毒復合侵染的樣品，每一種病毒都需要獨立檢測，判定結果時會出現臨界值存在的缺陷，造成檢測結果存在一定偏差。近年來，隨著科技的發展，以病毒核酸為研究的分子檢測技術RT-PCR[7-8]更為靈敏、具有特異性，但檢測費用高，儀器需求嚴格，操作過程復雜，且部分藥品對人體有致癌的危害性，對操作人員的專業技術要求較高。

使用馬鈴薯病原菌芯片檢測方法，大大縮短了檢測時間，提高了工作效率與準確性。一般40個樣品，24 h就可以輕松出結果，且結果同時包含常規6種病毒、1種類病毒和4種細菌性病毒。雖然購買試劑盒和儀器一次性投入費用高，但利于檢測后工作的長期開展。簡單培訓相關技術人員即可上手檢測，程序簡化，判定結果一目了然，不存在處于臨界值的判定缺陷。只需1間試驗室分成4個不同模式的操作臺，避免各試驗步驟間相互交叉感染即可。試劑盒中所用的藥劑均為安全藥品，不會危及人體的健康。從種薯病毒檢測源頭抓起，定期抽檢種薯生產企業，督促各龍頭企業及種植戶自檢自查，提高種薯產量，提升馬鈴薯品質，形成一個良性循環的馬鈴薯種薯質量體系，從而增加經濟收入，促進馬鈴薯產業綠色可持續發展。