羊肚菌分類鑒定方法及人工栽培技術研究進展*

喬 婷，李峻志，戴 璐，賀曉龍，趙瑞華，高小朋**

（1.延安大學生命科學學院，陜西 延安 716000；2.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

羊肚菌（Morchella spp.）是一種珍稀的食藥兼用真菌，隸屬于子囊菌門（Asomycota）盤菌綱（Pezizomycetes）盤菌目 （Pezizales）羊肚菌科 （Morchellaceae），其風味獨特，富含多種活性物質，在世界范圍內具有很高的科學價值和經濟價值[1]。據報道，羊肚菌的栽培是近100多年來的研究熱點，很早以前就有過關于食用野生羊肚菌的相關記錄，隨著其營養價值逐漸被發現，研究人員開始深入研究羊肚菌的生態分布特征、系統發育關系、人工栽培技術以及食（藥）用功效等[2-3]。但是對于羊肚菌分類鑒定方法和科學的人工栽培技術研究一直都備受爭議。因此，通過對目前羊肚菌的分類鑒定方法及人工栽培技術（主要包括菌種和外源營養兩大難題）進行綜述，以期為羊肚菌的優良種質資源開發和人工栽培技術研究提供科學思路，為產業的良性健康發展奠定扎實的理論基礎。

1 羊肚菌分類鑒定方法

1.1 形態分類鑒定

早期研究主要是依據宏觀和微觀形態特征對羊肚菌屬進行分類。宏觀特征主要包括菌蓋、菌柄、子囊果的形狀、大小、顏色，菌蓋與菌柄交界處的特征，脊和凹坑的排列、形態、顏色等；微觀方面主要包括子囊的形狀、分布特征，子囊孢子和側絲的形狀、直徑、顏色，剛毛的形態、大小，菌蓋上是否有絨毛、菌柄上是否有顆粒附著物以及其形態和大小等。此外，羊肚菌不同時期菌絲的形態特征、孢子印顏色、菌核的形態、形成時間以及在培養基上的分布特征等，都可以輔助進行羊肚菌的形態學分類[4]。在英國真菌索引數據庫（Index Fungorum）中，羊肚菌屬記錄有350個名稱物種，去除同物異名的情況，全球可能有近150個形態學物種[5]。根據羊肚菌菌蓋顏色、棱紋走向、菌蓋凹陷深淺及形狀、菌蓋邊緣是否明顯向外伸展、菌蓋近中部與菌柄是否分離等特征，將羊肚菌分為黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類及半開羊肚菌類共3個形態分類單元[6-9]。根據成熟時子囊果的子實層和菌柄變紅與否提出了第四個類群，即變紅羊肚菌類群[10]。最新研究證明，使用復水、脫水、臨界點干燥制備技術對羊肚菌子囊孢子進行掃描電子顯微鏡（SEM）成像，可以提高孢子壁表面的分辨率，從而增加形態學特征的數量[11]。羊肚菌表型特征往往與地理發生或生態學相輔相成，特別是與特定喬木或灌木的假定關系，有時也可以提供形態分類信息[12]。但可用于羊肚菌屬物種形態學分類的特征較少，且同一物種內形態學特征差異較大，形狀、顏色和大小又會隨著環境、地理位置的變化發生改變，甚至在不同生長階段都存在較大差異，因此造成羊肚菌同物異名和同名異物的現象頻出[13-14]。

1.2 系統發育學分子鑒定

系統發育學分子鑒定是以DNA序列為特征，通過測定一個或者幾個標準的目的基因，如真菌中的ITS、LSU等DNA序列，來進行物種多樣性分析以構建正確的物種鑒定體系[4]。截止2010年，羊肚菌屬的分子系統標記以核糖體DNA的內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）為主；之后，隨著分子生物學技術的發展，多基因聯合分析技術形成，可通過多個基因的核苷酸序列構建系統發育樹，比較其拓撲學關系，并以此界定物種[15]，截至目前，該方法一直是羊肚菌分類研究的主要方法。

1.2.1 單基因測序

在過去很長一段時間中，ITS被用作分析環境樣本中真菌多樣性的靶標，ITS序列分析技術廣泛用于真菌的分子鑒定和系統發育分析，但基因庫（Gen－Bank）中ITS數據來源廣泛，其命名的準確性直接影響基于ITS序列分析的鑒定結果[16]。此外，有學者通過研究國際序列數據庫，估計了真菌界目前可獲得的所有真菌種內ITS變異性；在數據庫內部發現了巨大的差異，其結果難以將分類單元的分類隸屬關系或營養模式相關聯；而對于種內變異，似乎沒有一個統一而嚴格的上限適用于整個真菌界，例如典型的3%閾值。因此，不應使用簡化的方法來實現基于ITS的物種界定[17]。

1.2.2 多基因聯合測序

鑒于此，研究人員在ITS序列分析的基礎上，通過增加LSU、rpb1、rpb2和tef1多個基因的DNA序列來界定物種，使分類與鑒定結果更加科學和客觀[18]。研究結果證實，如使用單一的ITS序列鑒定羊肚菌屬物種，僅有約76%的系統發育學物種可以被識別；而利用4基因進行聯合分析（ITS+tef1+rpb1+rpb2），則可以鑒定出該屬的所有物種[19-20]。在此研究基礎上，研究人員提出羊肚菌屬由黃色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade）和變紅羊肚菌支系 （Rufobrunnea Clade）構成[21]，這一結論較形態學分類更加準確。隨著羊肚菌分類研究的深入，羊肚菌多基因序列模標數據庫（Morchella Multilocus Sequence Typing，Morchella MLST）[20]應運而生，這一數據庫的建立為研究人員更加準確地鑒定羊肚菌提供了便利。截止目前，該數據庫包含了分別為ITS、LSU、rpb1、rpb2和tef1等5個片段的2 406條羊肚菌基因序列，其中羊肚菌研究專家提供了2 160條序列，另外246條序列來源于GenBank且已被證明其準確無誤。相關學者可以通過該數據庫獲得羊肚菌序列數據、相應的物種名稱及館藏標本或培養物等信息，同時也可以向該網站提供有關羊肚菌的可靠的DNA序列數據[22]。

2 人工栽培研究進展

2.1 人工栽培的關鍵影響因素

目前，影響羊肚菌人工栽培成功與否的因素較多，主要包括栽培品種的選擇、栽培季節的安排、制種技術、播種技術、營養袋技術、環境調控技術等，但菌種技術和外源營養補料技術仍然是影響我國羊肚菌產業化快速發展的兩項關鍵因素[23-24]。

2.1.1 菌種

菌種幾乎是所有食用菌栽培的關鍵，菌種的質量差異直接影響著栽培的成功與否。而羊肚菌是一種生活史較為復雜的子囊菌，從初期子囊孢子萌發成菌絲體，菌絲生長后期通過緊密連接交織形成休眠體結構“菌核”，到最終形成子囊果從而又產生分生孢子，其機制可能與遺傳背景、發育和環境條件等密切相關。且由于羊肚菌的菌核沒有明顯的菌核結構特征，又被稱為“假菌核”。研究表明，羊肚菌菌核的形成情況與菌種的活力、純度、培養條件以及培養基配方等密切相關[25-26]。最新研究檢測出只有一種交配型基因存在于羊肚菌菌核中，因此可考慮將其作為選育菌種的材料，但菌核與羊肚菌子實體的形成以及產量之間的關系有待進一步研究[27]。此外，羊肚菌栽培過程中會產生大量的分生孢子，最新研究成果表明，羊肚菌分生孢子由營養菌絲產生，部分分生孢子包含1個～3個核；結合相關研究成果推測，分生孢子可能通過3種途徑參與羊肚菌子實體的形成過程，極有可能是作為精子細胞提供相反的交配型基因，也可能萌發成雌雄同體的兼性菌絲體，或作為生殖繁殖體參與其生殖過程；但羊肚菌分生孢子的發生與子實體形成以及是否為栽培中必不可少的階段仍舊沒有定論[28-29]。由于目前對羊肚菌復雜的生物學基礎研究較少，嚴重制約了羊肚菌野生品種馴化以及新品種選育的進度。因此，目前人工栽培的羊肚菌品種仍然集中在黑色類群中，包括梯棱羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sextelata）、七妹羊肚菌（M.exima）、頭絲羊肚菌（M.exuberans）、歐氏羊肚菌（M.owneri）、Mel-13和Mel-21在內的7個系統發育種，其中以六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌栽培規模最大[30]。而其他品種的羊肚菌是否可以進行人工栽培尚不清楚，有待進一步研究[31]。

系統科學的羊肚菌菌種質量評價體系對產業的發展必不可少，但羊肚菌菌絲體的形態特征隨著培養基的變化表現出不穩定性，這無形中提高了菌種質量評價的難度[32-33]。因此，我國尚無明確的羊肚菌菌種質量標準，大部分菇農僅根據菌核數量來判斷羊肚菌菌種質量。最新研究表明，通過對羊肚菌菌株分類地位、交配型基因、菌株活力綜合評估，可確保菌株在人工栽培過程中表現出優良、穩定的性狀[34]。另一方面，菌種老化是羊肚菌栽培過程中的普遍現象。研究發現羊肚菌菌種老化與頻繁地傳代培養、不當的培養和保存條件、或營養環境不匹配相關[35]；也有研究表明羊肚菌菌種老化機制與線粒體活性相關，但對于指導生產來說還是缺乏系統的研究[36]。目前生產者對于此問題的解決辦法是反復從孢子培養物中重新選擇菌種，但依然難以保證菌種的穩定性[37]?；诖?，研究人員只有通過選育多個性狀優良、產量穩定、可人工栽培的品種，同時深入研究羊肚菌菌種老化以及菌種與子實體形成之間的內在機制，才能加快羊肚菌人工栽培技術的發展。

2.1.2 外源營養

外源營養袋技術的發展，較好地解決了羊肚菌人工栽培過程中營養補給這一難題，我國研究人員經過數十年的科研和實踐，使該技術日趨成熟。但在外源營養袋的使用過程中，菇農們對于營養袋的科學配比、制作技術、放置時間、數量以及撤袋時間等仍眾說紛紜，因此營養袋作用機制的研究尤為重要[24，38]。

外源營養袋技術是羊肚菌栽培過程中的關鍵環節，只有準確地掌握其制作和使用的技術要點，才能提高出菇的質量和產量。研究發現，外源營養袋的配比與羊肚菌的出菇周期、產量呈正相關性，如按照小麥58%、闊葉樹木屑30%、腐質土10%、石膏1%、石灰1%的配比，既有利于縮短梯棱羊肚菌的出菇周期，也可以提高產量；放置外源營養袋時，采用“一”字形狀的劃口，有利于降低污染率、提高產量[39]。研究人員通過檢測并分析了7種常見食用菌栽培原料的化學成分，結合栽培試驗驗證，探究了羊肚菌栽培產量背后的營養袋化學成分差異效應，為現有的營養袋配方提供了理論支撐[40]。另外，通過研究營養袋相關因素對羊肚菌生長的影響，發現施放營養袋時間與出菇期呈正比，營養袋中麥粒含量與子實體產量也呈正比[41]。也有研究發現，外源營養袋的重量變化量和子實體產量成正相關；當外源營養袋重量減輕＞50%，羊肚菌產量才可以達到正常產量（2 250 kg·hm-2）以上[42]。

有研究通過使用放射性標記發現，在羊肚菌營養生長過程中，從營養豐富到營養貧乏環境的改變，可以誘導真菌進入生殖生長周期，在此周期中形成子囊果[43-46]。為了研究羊肚菌的營養轉運機制，Amir等[47]用細胞壓力探針測定了分割平板培養羊肚菌時菌絲和菌核中膨壓的變化；對于包括羊肚菌在內的形成菌核的真菌，菌絲的生長、菌核的形成和發育過程中，存在著菌絲和菌核的變化以及兩者之間物質的轉運；影響物質轉運的因素包括培養基的水勢梯度和菌絲、菌核的代謝活性及其膨壓差[48]。為了研究羊肚菌的分解及營養運輸機制，研究人員對一株可人工栽培的羊肚菌進行了基因組測序，并鑒定了營養袋分解裝置的編碼基因；然后用轉錄組學和宏蛋白質組學結合生物化學技術，分析編碼后碳水化合物活性酶（CAZymes）的表達情況；結果表明，羊肚菌營養菌絲體定植于外源營養袋上，釋放出一系列降解酶，有效分解和代謝多糖，如小麥和稻殼中的淀粉和纖維素；經此分解機制釋放的代謝產物運輸到菌床附近的土壤表層，進而誘發子實體形成；該發現有助于更詳細地描述誘發羊肚菌子實體形成的分子機制[49]。

2.2 栽培模式

2.2.1 大田栽培模式

隨著羊肚菌人工栽培技術的日益成熟，我國在田間和林下栽培羊肚菌的規模迅速擴大。其中大田栽培主要包括田地的選擇與整理、菌種制備、播種、補料技術、保育催菇、出菇管理和采收干制等主要環節。為了降低生產成本，合理利用林木資源和土地空間，學者和菇農也嘗試通過模擬自然環境林下栽培羊肚菌，并經研究發現，羊肚菌林下設施栽培中，在栽培床上方采取“搭建小弓棚+覆蓋薄膜”的方式，比單純覆蓋遮陽網的方式產量更高[50]。

2.2.2 設施化栽培模式

由于羊肚菌大田露天栽培易受氣候和土壤的強烈影響，風險較大；如2021年氣候反常，全國冬季平均氣溫集中在4℃～12℃，導致多地出菇過早，羊肚菌的營養生長還未達到生理成熟，同時由于溫差變化較大，發生大面積死菇，給羊肚菌栽培者造成巨大損失[51]。隨著產業大規模發展，為了減少自然氣候條件對羊肚菌栽培造成的影響，近幾年越來越多的從業者開始摸索適宜當地氣候條件的設施化栽培模式。所謂設施化栽培，主要是通過機械設備干預，采用工程技術手段，創建適宜羊肚菌生長的氣候條件。根據地域差異，目前羊肚菌設施栽培主要以“南方冷棚、北方暖棚”2種模式為代表[52]。

1）南方冷棚

南方地區的冷棚以簡易的塑料大棚為代表，用鍍鋅鋼架為主要材料，棚頂覆蓋塑料薄膜。冷棚搭建成本低、速度快、使用方便[53]。但冷棚栽培羊肚菌的周期較長，一般需要經過5個月～6個月的管理，才可以出菇。

2）北方暖棚

為了抵御惡劣氣候環境的影響，北方暖棚多為半拱形，呈坐北朝南建設[54]。暖棚羊肚菌栽培一般從11月上旬開始播種，經過菌絲著床萌發、地表菌霜形成、菌霜消失，共計需要50 d～60 d，次年元旦前后進行出菇管理，栽培周期相對較短[55]。

2.2.3 工廠化栽培

雖然以上2種模式從某種程度上可以保證羊肚菌人工栽培的成功率，但無法實現羊肚菌的周年化栽培，因此研究人員在室內工廠化栽培方面不斷地探索，并取得一定成效。

美國Garry Mill早在1982年就進行了羊肚菌工廠化栽培的研究，并于2005年獲得成功，使整個栽培周期只需要70 d[38]，這是世界上迄今為止唯一實現羊肚菌工廠化栽培的典型。而在我國食用菌產業快速工業化發展的大趨勢下，羊肚菌的室內栽培技術也成為了當下研究的重點。研究表明，目前記錄的羊肚菌大部分屬于低溫型菌類；在菌絲營養生長階段，需控制生產車間溫度在15℃～18℃，培養基質含水量為70%～80%；生殖生長階段，子實體最適宜的溫度為13℃～16℃，空氣相對濕度保持在85%～95%，光照為 400 lx～500 lx，CO2濃度＜0.3%[38]。根據最近報道，中國科學院昆明植物研究所珍稀食用菌研究團隊于2021年2月，成功研發出羊肚菌工廠化栽培成套新技術，初步實現了工廠化栽培羊肚菌[56]。

3 展望

從最初采食野生羊肚菌，到目前實現大面積人工栽培，羊肚菌產業雖然取得了突破性進展，但仍然有下述諸多問題，致使其長期處于供給不足的狀態。

1）目前我國僅有梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌2個主栽品種，人工栽培品種的可選擇性較少，不能滿足產業發展需求，且這2個主栽品種菌種老化、退化的現象明顯。

2）由于栽培用菌種和外源營養補給的不穩定性，導致了整個產業發展的不穩定。

3）缺乏系統、標準的人工栽培技術規范等。

為了實現產業長足發展，在進行羊肚菌的分類鑒定時，如果能將形態學分類和多基因聯合分析技術有效結合，將進一步提升羊肚菌屬物種鑒定的準確性。在此基礎上，結合最新理論研究成果，加強育種技術的開發，完善和推廣生產用菌種質量評價體系，深入外源營養供給體系機制研究，必將有力推進羊肚菌工廠化栽培產業的發展。