寧肺活血利水方對(duì)慢性阻塞性肺疾病合并肺動(dòng)脈高壓外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞計(jì)數(shù)及功能影響的臨床及實(shí)驗(yàn)研究

冷報(bào)浪 張?jiān)葡?趙娜 王海燕 馮霞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的肺部疾病,慢性炎癥可導(dǎo)致肺實(shí)質(zhì)破壞和肺血管的異常而形成肺動(dòng)脈高壓。肺動(dòng)脈高壓是COPD 的重要并發(fā)癥之一,是 COPD 病程發(fā)展為肺源性心臟病(肺心病)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),嚴(yán)重影響COPD 患者的生存質(zhì)量及預(yù)后［1］。如能早期有效地控制肺動(dòng)脈高壓,對(duì)提高COPD 患者的生存質(zhì)量,改善預(yù)后,防止肺心病的發(fā)生具有重要意義。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞［2］,EPCs 在COPD 合并肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程中起著重要的作用,研究顯示中藥治療可以有效改善EPCs 功能,從而有效地治療COPD 合并肺動(dòng)脈高壓［3］。因此,本研究應(yīng)用寧肺活血利水方治療COPD 合并肺動(dòng)脈高壓患者取得較好療效,并研究對(duì)外周血EPCs 數(shù)量及功能的影響,進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討相關(guān)機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 臨床研究

1.1 資料與方法

1.1.1 一般資料 選取2018 年11 月～2021 年11 月本院呼吸內(nèi)科接治的門診或住院的60 例COPD 合并肺動(dòng)脈高壓患者,所有病例符合C0PD 合并肺動(dòng)脈高壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4,5］,且為急性發(fā)作期［6］。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分成對(duì)照組和研究組,各30 例。

1.1.2 治療方法 對(duì)照組參照COPD 診治規(guī)范［4］采用常規(guī)抗感染、止咳、化痰、平喘及對(duì)癥治療。研究組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上口服寧肺活血利水方,方藥組成：桑白皮10 g、澤蘭10 g、浙貝母10 g、葶藶子6 g、法半夏10 g、丹參20 g、瓜蔞皮15 g、廣郁金10 g。水煎服,1 劑/d。兩組均不得使用其他血管活性藥物,療程均為4 周。

1.1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 比較兩組治療前后中醫(yī)證候積分、肺動(dòng)脈壓、外周血EPCs 計(jì)數(shù)及功能、臨床治療效果。

1.1.3.1 EPCs 計(jì)數(shù)及功能 在無(wú)菌條件下清晨抽取患者空腹?fàn)顟B(tài)下的肘靜脈血15 ml,使用肝素抗凝并輕輕混勻,4 h 內(nèi)離心分離血清,分裝后保存于-80℃冰箱,標(biāo)本收集完成后統(tǒng)一進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。參照文獻(xiàn)方法［7,8］對(duì)標(biāo)本進(jìn)行EPCs 分離、培養(yǎng)鑒定及計(jì)數(shù),以淋巴分離液經(jīng)密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng),免疫熒光法鑒定雙熒光陽(yáng)性細(xì)胞得到EPCs,最后應(yīng)用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)每10 萬(wàn)個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中CD34+VEGFR-2+CD45-的EPCs 所占的比例。按實(shí)驗(yàn)步驟,在 EPCs 中加入 LCCK-8 溶液培養(yǎng),酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度,測(cè)定EPCs 增殖能力；用胰蛋白酶消化液、PBS 洗脫后,計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞,測(cè)定EPCs 粘附能力；用胰蛋白酶消化液、EBM-2 培養(yǎng)后,計(jì)數(shù)遷移到底層的細(xì)胞數(shù),測(cè)定EPCs 遷移能力。

1.1.3.2 中醫(yī)證候積分、肺動(dòng)脈壓 參照《中醫(yī)內(nèi)科病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》［9］對(duì)患者的癥狀、體征等進(jìn)行評(píng)分,主要包括咳嗽、咳痰、胸悶、喘憋、氣短、乏力、心悸、哮鳴音、睡眠等,每項(xiàng)0～3 分,0 分為無(wú)癥狀；1 分為輕微；2 分為較明顯能忍受,但不影響生活；3 分為顯著并影響生活。采用多普勒超聲心動(dòng)圖法測(cè)定患者肺動(dòng)脈壓的變化。

1.1.3.3 療效判定標(biāo)準(zhǔn)［10］通過(guò)尼莫地平法,根據(jù)治療前后肺動(dòng)脈壓變化情況進(jìn)行療效評(píng)價(jià)：控制：癥狀、體征基本消失,中醫(yī)證候積分下降≥95%,且肺動(dòng)脈壓恢復(fù)到正常水平；顯效：癥狀、體征有顯著改善,70%≤中醫(yī)證候積分下降<95%,肺動(dòng)脈壓降低>15%；有效：癥狀、體征有所緩解,30%≤中醫(yī)證候積分下降<70%,肺動(dòng)脈壓降低5%～15%；無(wú)效：癥狀、體征無(wú)顯著改善,未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。總有效率=(控制+顯效+有效)/總例數(shù)×100%。

1.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 結(jié)果

1.2.1 兩組患者治療前后中醫(yī)證候積分、肺動(dòng)脈壓比較 治療前,兩組患者中醫(yī)證候積分、肺動(dòng)脈壓比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后,兩組中醫(yī)證候積分、肺動(dòng)脈壓均較治療前降低,且研究組顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者治療前后中醫(yī)證候積分、肺動(dòng)脈壓比較 ()

表1 兩組患者治療前后中醫(yī)證候積分、肺動(dòng)脈壓比較 ()

注：與本組治療前比較,aP<0.05；與對(duì)照組治療后比較,bP<0.05

1.2.2 兩組患者治療前后外周血EPCs 計(jì)數(shù)及功能比較 治療前,兩組患者EPCs 計(jì)數(shù)、EPCs 增殖能力、EPCs 遷移能力、EPCs 粘附能力比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后,兩組EPCs 計(jì)數(shù)、EPCs 增殖能力、EPCs 遷移能力、EPCs 粘附能力均較治療前升高,且研究組高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者治療前后外周血EPCs 計(jì)數(shù)及功能比較()

表2 兩組患者治療前后外周血EPCs 計(jì)數(shù)及功能比較()

注：與本組治療前比較,aP<0.05；與對(duì)照組治療后比較,bP<0.05

1.2.3 兩組患者臨床治療效果比較 研究組的治療總有效率為93.33%,明顯高于對(duì)照組的73.33%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組患者臨床治療效果比較 (n,%)

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與方法

2.1.1 材料 收集30 只8周齡的雄性SD 大鼠,體質(zhì)量150～200 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。隨機(jī)分為模型組、干預(yù)組及空白對(duì)照組,每組10 只。

2.1.2 方法 先進(jìn)行動(dòng)物造模,模型組及干預(yù)組于項(xiàng)背部皮下注射 1%的野百合堿(monocrotaline,美國(guó)Sigma 公司)50 mg/kg,以誘導(dǎo)形成肺動(dòng)脈高壓模型;空白對(duì)照組注射等量PBS。注射當(dāng)天為第0 天。干預(yù)組于第3 天開始予以寧肺活血利水方水煎液20 ml/kg灌胃,寧肺活血利水方方藥組成同臨床研究,由醫(yī)院中藥房自動(dòng)煎藥機(jī)煎煮成水煎液,每劑中藥劑量煎成150 ml×2 袋；模型組以等量蒸餾水灌胃,總共21 d。第21 天三組大鼠經(jīng)尾靜脈取血,進(jìn)行循環(huán)EPCs 含量測(cè)定,并分別采用EPCs 體外培養(yǎng)8 d 進(jìn)行相對(duì)增殖能力檢測(cè)、用PBS 洗脫法進(jìn)行相對(duì)粘附能力檢測(cè)、用單層細(xì)胞法進(jìn)行相對(duì)遷移能力檢測(cè)［11］。經(jīng)靜脈采血后的大鼠以10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉,自右側(cè)頸外靜脈插管至右心室,應(yīng)用PM-8000 型多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀測(cè)定RVSP,以此間接反映肺動(dòng)脈壓［12］。

2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 空白對(duì)照組RVSP 低于模型組及干預(yù)組,EPCs 計(jì)數(shù)、EPCs 增殖數(shù)、EPCs 粘附能力、EPCs 遷移能力高于模型組及干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ；干預(yù)組RVSP 低于模型組,EPCs 計(jì)數(shù)、EPCs 增殖數(shù)、EPCs 粘附能力、EPCs 遷移能力高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 三組大鼠RVSP、靜脈血中EPCs 計(jì)數(shù)及功能比較()

表4 三組大鼠RVSP、靜脈血中EPCs 計(jì)數(shù)及功能比較()

注：與空白對(duì)照組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05

3 討論

COPD 由于反復(fù)發(fā)作常致伴發(fā)肺動(dòng)脈高壓,而肺動(dòng)脈高壓是COPD 向肺心病發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。治療上降低肺動(dòng)脈壓和肺血管阻力有積極意義,但血管擴(kuò)張劑由于選擇性差使臨床應(yīng)用受限,雖然有新的藥物與療法的開發(fā)和應(yīng)用使得肺動(dòng)脈高壓的臨床癥狀能夠在一定程度上得到改善,但遠(yuǎn)期預(yù)后依舊不佳,且在COPD合并肺動(dòng)脈高壓患者,中作用未得到證實(shí)［13］。國(guó)內(nèi)中西醫(yī)結(jié)合的研究顯示,中醫(yī)藥有較好的降肺動(dòng)脈壓作用。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為COPD 可按咳嗽、喘證、哮證、痰飲、肺脹、胸痹等范疇辨證論治,其病因病機(jī)復(fù)雜,特別是COPD 發(fā)展到肺動(dòng)脈高壓階段由于病情反復(fù)發(fā)作,病機(jī)錯(cuò)綜和病理因素復(fù)雜及相互影響和轉(zhuǎn)化,其痰濁久留,肺氣郁滯,心脈失暢,瘀阻血脈,“血不利則為水”,終至痰、血、水錯(cuò)雜為患。“法隨證立、方從法出”,故確立了復(fù)法合方辨治手段,應(yīng)用寧肺活血利水方治療COPD 合并肺動(dòng)脈高壓患者,該方由桑白皮、葶藶子、浙貝母、法半夏、澤蘭、丹參、瓜蔞皮及廣郁金等組成。全方具有寧肺活血利水之功,又具化痰瀉肺平喘之效,可達(dá)氣血水諸證兼顧之能。本文前期研究結(jié)果顯示［14］,該方對(duì)治療COPD 合并肺動(dòng)脈高壓患者有較好的臨床療效,本課題進(jìn)一步研究了該方治療COPD 合并肺動(dòng)脈高壓患者的療效,并研究對(duì)外周血EPCs 數(shù)量及功能的影響,同時(shí),通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討相關(guān)機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示,研究組患者在常規(guī)對(duì)癥治療基礎(chǔ)上加用寧肺活血利水方,治療4 周。治療后研究組患者中醫(yī)證候積分顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與相關(guān)研究報(bào)道基本一致［15］。由此看出,寧肺活血利水方有助于改善COPD 合并肺動(dòng)脈高壓患者的癥狀。同時(shí),治療后,兩組肺動(dòng)脈壓均較治療前降低,且研究組顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示在常規(guī)西藥治療基礎(chǔ)上服用中藥寧肺活血利水方,能有效降低肺動(dòng)脈壓,進(jìn)而改善心肺功能,顯示了中西醫(yī)結(jié)合在COPD 合并肺動(dòng)脈高壓治療中的臨床價(jià)值。

在COPD 的反復(fù)發(fā)作過(guò)程中,由于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷并呈進(jìn)行性加重,導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓以及肺心病,研究顯示血管祖細(xì)胞參與內(nèi)膜增生的發(fā)病機(jī)制主要通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)相關(guān)信號(hào)［16］。內(nèi)皮細(xì)胞受到各種病理因素刺激損傷后會(huì)逐漸導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。EPCs 是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,研究發(fā)現(xiàn)COPD 患者的長(zhǎng)期缺氧狀態(tài)以及炎癥因子刺激可導(dǎo)致外周血EPCs 數(shù)量減少和功能受損,在COPD 肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程中起著重要的作用［17］。因此,改善COPD 患者外周血的EPCs 計(jì)數(shù)及功能,可以保護(hù)并修復(fù)COPD 患者的血管內(nèi)皮功能,改善肺動(dòng)脈高壓,對(duì)于COPD 合并肺動(dòng)高壓的防治具有重要意義。既往的研究顯示［18］,在體外試驗(yàn)中具有活血化瘀作用的姜黃素可增加COPD 患者外周血EPCs 計(jì)數(shù),并改善EPCs 增殖功能。

在本課題臨床研究中發(fā)現(xiàn),治療后,兩組EPCs 計(jì)數(shù)、EPCs 增殖能力、EPCs 遷移能力、EPCs 粘附能力均較治療前升高,且研究組高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。顯示寧肺活血利水方在有效降低肺動(dòng)脈壓的同時(shí),能增加 COPD 合并肺動(dòng)脈高壓患者外周血EPCs 計(jì)數(shù),并明顯改善EPCs 增殖能力、遷移能力、粘附能力。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)野百合堿造模的肺動(dòng)脈高壓大鼠予以寧肺活血利水方水煎液灌胃治療后,干預(yù)組RVSP 低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。客觀地證實(shí)了寧肺活血利水方能有效降低肺動(dòng)脈壓。同時(shí)發(fā)現(xiàn),大鼠尾靜脈血循環(huán)EPCs 含量增加,對(duì)分離的EPCs 分別進(jìn)行增殖能力、遷移能力、粘附能力檢測(cè),結(jié)果顯示,干預(yù)組EPCs 計(jì)數(shù)、EPCs 增殖數(shù)、EPCs 粘附能力、EPCs 遷移能力高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述,在常規(guī)對(duì)癥治療基礎(chǔ)上加用寧肺活血利水方能有效提高COPD 合并肺動(dòng)脈高壓患者的臨床療效,能明顯降低肺動(dòng)脈壓,進(jìn)而改善心肺功能；能夠有效增加外周血EPCs 計(jì)數(shù),明顯改善EPCs 增殖能力、遷移能力、粘附能力,這可能是寧肺活血利水方有效降低肺動(dòng)脈壓的一個(gè)重要機(jī)制。