表面活性劑對鞣花酸的增溶及其抗氧化性能研究

伍佑輝，蔣新元，倪丹，賀靖雁，唐玉蓮，龐亞輝，段泉

(1.中南林業科技大學 理學院，湖南 長沙 410004；2.中南林業科技大學 材料科學與工程學院，湖南 長沙 410004；3.湖南省木本生物質轉化工程技術研究中心，湖南 長沙 410004)

鞣花酸是一種植物多酚，幾乎不溶于水及醇類溶劑，而溶于吡啶、二甲基亞砜和三乙醇胺等[1-2]。既能抗炎、抗菌、抗病毒，又可以抗氧化、美白、抗衰老[3-4]，在化妝品中有很好的應用前景。它已列入《國際化妝品原料標準目錄》(INCI)，也被列入國家食品藥品監督管理局發布的《國際化妝品原料標準中文名稱目錄》中[5]。研究[6]表明化妝品里所添加的鞣花酸含量極低，很難達到標注所說的美白功能及抗衰老能力。

本實驗研究了非離子型表面活性劑對鞣花酸的增溶作用，及鞣花酸在表面活性劑增溶體系中對自由基的清除能力，為擴大鞣花酸在化妝品[7]、醫藥等領域的應用提供基礎支持。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

鞣花酸(w=98%)、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、DPPH、ABTS均為分析純；維生素C(簡稱Vc)。

TM-1810型紫外可見分光光度計；85-2A數顯恒溫磁力攪拌器；BHS-1數顯恒溫水浴鍋；1510酶標儀；96孔板。

1.2 實驗方法

1.2.1 鞣花酸在非離子表面活性劑溶液中的紫外光譜測定 在150 mL錐形瓶中分別加入30 mg的鞣花酸，再分別加入0.10 g/L的非離子表面活性劑Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80溶液各100 mL，置于磁力攪拌器上以500 r/min攪拌3 h，然后在35 ℃的恒溫水浴鍋中密封靜置24 h后定容搖勻，制備鞣花酸表面活性劑增溶體系。以相同濃度表面活性劑溶液作為參比，將制備鞣花酸表面活性劑增溶體系稀釋10倍后用紫外分光光度計測定其紫外吸收光譜。

1.2.2 表面活性劑溶液濃度對鞣花酸增溶的影響 選取增溶效果好的表面活性劑進行濃度對鞣花酸增溶的影響研究。在150 mL錐形瓶中各加入30 mg 的鞣花酸，再加入一定體積配制好的表面活性劑標準溶液，分別配制表面活性劑溶液濃度在0.001～50.00 g/L范圍的鞣花酸-表面活性劑增溶體系，然后置于磁力攪拌器上以500 r/min攪拌3 h，再在35 ℃ 的恒溫條件下密封靜置24 h后定容搖勻。以相應濃度表面活性劑溶液作為參比，鞣花酸表面活性劑增溶體系稀釋10倍后在397 nm波長下用紫外分光光度計測定其吸光度，重復3次，取平均值。根據鞣花酸表面活性劑增溶體系標準曲線，計算鞣花酸在表面活性劑溶液中的增溶濃度。

1.2.3 溫度對表面活性劑增溶鞣花酸的影響 選取濃度為10.00 g/L的表面活性劑溶液研究溫度對表面活性劑增溶鞣花酸的影響，其余操作方法同上，選擇溫度范圍5～45 ℃進行實驗研究，重復3次，取平均值。

1.2.4 鞣花酸表面活性劑增溶體系穩定性的測定 在10.00 g/L的表面活性劑溶液中加入30 mg的鞣花酸，制備鞣花酸增溶體系，操作方法同上，在35 ℃ 恒溫條件下存放，測定增溶體系中鞣花酸吸光度隨時間的變化，重復3次，取平均值。

1.2.5 鞣花酸表面活性劑增溶體系對ABTS·清除能力的測定 按照文獻[8]的方法，加以改進。ABTS溶液按照文獻[9]配制：精密稱取0.038 4 g的ABTS溶解于10 mL蒸餾水中，精密稱取0.006 7 g的過硫酸鉀溶解于10 mL蒸餾水中，避光冷藏放置16～24 h，得到ABTS母液。實驗時用蒸餾水稀釋，使其吸光度(λ=734 nm)在(0.7±0.1) 。

鞣花酸增溶體系的配制：以10.00 g/L的Tween-20溶液配制鞣花酸濃度為50 mg/L的Tween-20增溶體系。然后用相同濃度的Tween-20溶液為稀釋液，配制鞣花酸濃度在0.10～8.00 mg/L范圍的系列鞣花酸Tween-20增溶體系。

對照品Vc溶液的配制：配制濃度在0.10～8.00 mg/L范圍的系列Vc溶液，配制好的溶液需避光保存。

ABTS·清除率的測定：在96孔板中按照文獻[10]取液，混合液在室溫避光反應30 min后，用酶標儀在734 nm下測吸光度值，計算抑制率。每個樣品設置3個重復孔重復3次，取平均值。

ABTS·清除率(S,%)計算公式如下：

S=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(1)

式中A0——空白組(ABTS溶液+溶劑)的吸光度值；A1——樣品組(ABTS溶液+樣品)的吸光度值；A2——對照組(水+樣品)的吸光值。

1.2.6 鞣花酸表面活性劑增溶體系對DPPH·清除能力的測定 按照文獻[8]的方法，加以改進。DPPH溶液按照文獻[9]配制：稱取5 mg DPPH(精準至0.000 1 g)溶解于100 mL無水乙醇中，作為儲備液。實驗時用無水乙醇稀釋，使其吸光度(λ=517 nm)在(0.7±0.1)。

鞣花酸增溶體系的配制：同1.2.5節,稀釋配制鞣花酸濃度在0.20～10.00 mg/L范圍的系列鞣花酸Tween-20增溶體系。

對照品Vc溶液的配制：配制濃度在0.20～10.00 mg/L范圍的Vc溶液，配制好的溶液需避光保存。

DPPH·清除率的測定：在96孔板中按文獻[10]取液，混合液在室溫避光反應30 min后，用酶標儀在517 nm下測吸光度值，計算抑制率。每個樣品設置3個重復孔重復3次，取平均值。

DPPH·清除率(S，%)計算公式如下：

S=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

式中A0——空白組(DPPH溶液+水)的吸光度值；A1——樣品組(DPPH溶液+樣品)的吸光度值；A2——對照組(無水乙醇+樣品)的吸光值。

1.2.7 粒徑分布及Zeta電位測定 在室溫下，將鞣花酸Tween-20增溶體系溶液注入測試項目對應的比色容器中，在90°散射條件下對鞣花酸Tween-20增溶體系溶液的粒徑及電位進行測試，重復3次取平均值。

1.2.8 透射電鏡(TEM)分析 用滴管取少量鞣花酸Tween-20增溶體系溶液滴加置200目銅網上，待滴加樣品的銅網自然風干后，在50 ℃烘箱中干燥20 min除去多余的水分，然后置于TEM下尋找并分析鞣花酸Tween-20增溶體系溶液中的自聚體形態。

2 結果與討論

2.1 非離子表面活性劑對鞣花酸的增溶效果

2.1.1 鞣花酸表面活性劑增溶體系中的紫外吸收光譜特征 非離子表面活性劑吐溫(Tween)系列溶液中鞣花酸的紫外吸收光譜見圖1。

圖1 Tween系列溶液中鞣花酸的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectra of ellagic acid in Tween series solutions

由圖1可知，Tween系列溶液中鞣花酸在255 nm 處均有一個強吸收峰，在397 nm處有一個弱吸收峰，與鞣花酸在水溶液中的紫外吸收光譜保持一致[1]，說明鞣花酸在Tween系列溶液進行增溶后結構沒有發生改變，鞣花酸在Tween系列溶液保持了鞣花酸原有的性質和功效性。其中Tween-60的增溶效果明顯較低，而Tween-20、Tween-40、Tween-80溶液對鞣花酸的增溶效果相差不大，其中又以Tween-20的增溶效果最好。

2.1.2 鞣花酸在Tween-20溶液中標準曲線的測定 精確稱取12.5 mg鞣花酸，用10.00 g/L的Tween-20溶液進行溶解、攪拌、再使用超聲處理使其完全分散溶解后定容于250 mL容量瓶中，分別稀釋制備成鞣花酸濃度為1～25 mg/L系列鞣花酸Tween-20增溶體系，以相應濃度的Tween-20溶液為參比，于397 nm處測定鞣花酸的吸光度，以增溶體系的吸光度(A)對鞣花酸濃度(C,mg/L)作線性回歸，得標準曲線方程：A=0.045 65C-0.050 16(r=0.999 4)，見圖2，表明在1～25 mg/L內，增溶體系中鞣花酸的吸光度與鞣花酸的質量濃度呈良好的線性關系。

圖2 鞣花酸Tween-20增溶體系的標準曲線Fig.2 Standard curve of ellagic acid Tween-20 solubilizing system

2.1.3 Tween-20溶液濃度對鞣花酸增溶效果的影響 不同濃度的Tween-20溶液對鞣花酸的增溶效果見圖3。

圖3 Tween-20溶液濃度對鞣花酸的增溶效果的影響Fig.3 Solubilization effect of Tween-20 solution concentrations on ellagic acid

由圖3可知，當Tween-20溶液濃度較低時，鞣花酸的增溶隨著Tween-20溶液濃度的增加而顯著增加，當Tween-20溶液濃度達到1.00 g/L的時候，鞣花酸的增溶增長則變得比較緩慢，當Tween-20溶液濃度達到10.00 g/L以上的時候，鞣花酸的增溶不再隨著Tween-20溶液濃度的增加而增加，甚至出現下降的趨勢，可能是由于Tween-20溶液濃度較高時，溶液粘度較大，同時Tween-20分子間更易形成氫鍵，從而影響了鞣花酸分子在Tween-20分子聚氧乙烯鏈上的增溶。10.00 g/L的Tween-20溶液中鞣花酸的濃度為238.59 mg/L，相應溫度下鞣花酸飽和水溶液的濃度為10.12 mg/L，約為水中溶解的鞣花酸質量濃度的24倍，因此，選取10.00 g/L的Tween-20溶液作為鞣花酸的增溶液來進行后續實驗。

2.1.4 溫度對Tween-20溶液增溶鞣花酸的影響 不同溫度下， Tween-20溶液對鞣花酸的增溶情況見圖4。

圖4 溫度對鞣花酸在Tween-20溶液中增溶的影響Fig.4 Effect of temperature on solubilization of ellagic acid in Tween-20 solution

由圖4可知，在溫度較低時隨溫度升高，鞣花酸在Tween-20溶液增溶效果逐漸提高，但增長不顯著，當溫度升高到35 ℃后，鞣花酸的增溶量變化趨緩，說明溫度變化對鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶效果影響不大。在本論文實驗中選擇35 ℃進行實驗。

2.1.5 鞣花酸Tween-20增溶體系的穩定性 由圖5可知，鞣花酸Tween-20增溶體系在前8 d的吸光度數據較穩定，但從第8 d開始，吸光度出現驟降，第12 d以后，吸光度開始成規律性緩慢下降。綜上，鞣花酸Tween-20增溶體系在開始配制好的一段時間內有較好的穩定性，但隨時間延長，穩定性有所下降。

圖5 鞣花酸Tween-20增溶體系穩定性隨時間的變化Fig.5 Stability of ellagic acid Tween-20 solubilized system with time

2.2 鞣花酸Tween-20增溶體系的抗氧化作用

目前，常用DPPH·、ABTS·、超氧陰離子自由基、羥基自由基等清除實驗及脂質過氧化抑制實驗和總抗氧化能力的測定等方法來測定抗氧化性物質的體外活性[11]。由于在超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除實驗中要用到FeSO4，而FeSO4易與鞣花酸生成藍色絡合物，從而影響測定結果，故實驗室常用DPPH·清除[9]、ABTS·清除[10]分析鞣花酸的抗氧化作用[12-13]，本實驗使用酶標儀-微孔板法測定鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·、ABTS·的清除能力，并以Vc水溶液為對比。

2.2.1 鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·清除作用 由圖6可知，隨著溶液濃度的增加，鞣花酸Tween-20增溶體系和Vc水溶液均對ABTS·的清除率增加，在濃度較低的情況下，鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·的清除率明顯大于Vc水溶液對ABTS·的清除率，鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·的清除能力的IC50為0.31 mg/L，Vc水溶液的IC50為3.32 mg/L，說明鞣花酸作為一種很好的抗氧化活性成分經過表面活性劑增溶后其對ABTS·的清除能力不會受到影響，且增溶體系對ABTS·的清除能力優于Vc。

圖6 鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·的清除作用Fig.6 Scavenging effect of ellagic acid- Tween-20 solubilizing system on ABTS free radical

2.2.2 鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·的清除作用 由圖7可知，隨著鞣花酸和Vc濃度的增加，鞣花酸Tween-20增溶體系和Vc水溶液均對DPPH·的清除率增加，在濃度較低的情況下，鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·的清除率明顯大于Vc水溶液對DPPH·的清除率，在濃度較高時，二者清除率相近，鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·的清除能力的IC50為0.92 mg/L，Vc水溶液的IC50為2.40 mg/L。說明鞣花酸作為一種很好的抗氧化活性成分經過表面活性劑增溶后其對DPPH·的清除能力不會受到影響，且增溶體系清除DPPH·的能力優于Vc。

圖7 鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·的清除作用Fig.7 Scavenging effect of ellagic acid- Tween-20 solubilizing system on DPPH free radical

2.3 鞣花酸增溶體系的表征分析

2.3.1 粒徑及Zeta電位分析 鞣花酸Tween-20增溶體系中粒子的大小及其分布指數(PDI)見圖8。

圖8 鞣花酸Tween-20增溶體系的粒徑分布Fig.8 Particle size distribution of Tween-20 solubilized system

由圖8可知，該增溶體系的平均粒徑為(272.5±3.62) nm，PDI為0.230±0.010，Zeta-電位為(-41.57±1.88) mV，其粒徑呈正態分布，但也存在微量粒徑低于100 nm和高于3 000 nm以上的粒子，同時其電位的絕對值較大，說明增溶體系的穩定性較佳。

2.3.2 透射電鏡形貌觀察 通過粒徑分析，對鞣花酸增溶體系的粒徑大小有了大概的推論。為了更加直觀的判斷其微觀結構，采用TEM對鞣花酸增溶體系中的形態做更為具體的展示，結果見圖9。

由圖9可知，鞣花酸增溶體系中不僅發現了直徑約為40～100 nm(圖9A)、100～1 000 nm(圖9B)的聚集體，也有直徑約為3 000～6 500 nm的大聚集體(圖9C)，該現象與粒徑分布測試的結果一致。

圖9 鞣花酸Tween-20增溶體系透射電鏡形貌觀察圖Fig.9 TEM morphology of ellagic acid Tween-20 solubilized system

3 結論

四種Tween系列非離子表面活性劑溶液對鞣花酸的增溶效果表明，4種Tween溶液對鞣花酸都有增溶作用，其中以Tween-20的增溶效果最好，Tween-60的增溶效果最差。

溫度變化對鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶效果影響不大。在溫度為35 ℃下，Tween-20溶液濃度低于1.00 g/L時，鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量隨Tween-20溶液濃度的增大而大幅提高，Tween-20溶液濃度介于1.00～10.00 g/L時，鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量隨Tween-20溶液濃度的增大而增長趨緩，當Tween-20溶液濃度超過10.00 g/L后，鞣花酸在Tween-20溶液中的增溶量隨Tween-20溶液濃度的增大反而逐漸下降。當Tween-20溶液濃度為10.00 g/L時，鞣花酸增溶濃度達到了238.59 mg/L，約為鞣花酸飽和水溶液濃度(10.12 mg/L)的24倍。

隨著溶液濃度的增加，鞣花酸Tween-20增溶體系和Vc水溶液均對ABTS·和DPPH·的清除率增加，在濃度較低的情況下，鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·和DPPH·的清除率明顯大于Vc水溶液對ABTS·和DPPH·的清除率，鞣花酸Tween-20增溶體系對ABTS·的清除能力的IC50為0.31 mg/L，Vc水溶液的IC50為3.32 mg/L，鞣花酸Tween-20增溶體系對DPPH·的清除能力的IC50為0.92 mg/L，Vc水溶液的IC50為2.40 mg/L，說明鞣花酸經過表面活性劑增溶后其對ABTS·和DPPH· 的清除能力不會受到影響。

鞣花酸Tween-20增溶體系的平均粒徑為(272.5±3.62) nm、Zeta-電位為(-41.57±1.88) mV，電位的絕對值較大，表明其穩定性較好。