人乳頭瘤病毒分子檢測方法在宮頸癌篩查中的應用

劉磊 綜述劉婷婷 審校

營口經濟技術開發區中心醫院（營口市第六人民醫院）病理科，遼寧 營口 115007

宮頸癌是危害全球女性健康的第二大常見惡性腫瘤[1]。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)與宮頸癌的發生密切相關[2]。高危型HPV(high-risk HPV，hrHPV)的持續感染是誘發宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及浸潤性宮頸癌的重要因素[3]。隨著HPV分子檢測被納入宮頸癌篩查指南，分子檢測模式的篩選對于臨床醫生和患者均至關重要。美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)先后批準5種HPV分子檢測技術，即HC2 HPV、Cervista HPV HR、Cobas 4800 HPV、Aptima HPV及Onclarity HPV。由于檢測方法的多樣性，檢測結果的一致性變得尤為重要。HC2是首個獲得FDA批準的應于臨床的HPV檢測方法，其以較高的臨床敏感性和相對較高的特異性成為常規HPV檢測的金標準[4]。本文將以HC2為參考標準，比較不同檢測方法的優劣勢，并探討檢測結果的一致性問題。

1 HPV的結構和致病機制

HPV是一種無包膜、雙鏈DNA病毒，結構細分為早期(E)、晚期(L)區域和長控制區域，參與的蛋白主要包括衣殼蛋白L1、癌基因蛋白E6/E7[5]。L1具有自我組裝成病毒樣顆粒的特性，與適當佐劑結合用于HPV疫苗的研發[6]。癌基因E6/E7與宮頸上皮基底細胞基因組整合啟動E6/E7的轉錄合成。E6/E7蛋白產物抑制p53和視網膜母細胞瘤(pRb)的功能，進而誘導高級別上皮內瘤變(CIN2/CIN3)以及宮頸癌的發生[7-8]。至今已鑒定出的hrHPV有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，疑似高危型有53、66、70、73、82[9]。HPV不同亞型的持續感染誘發宮頸癌的能力各有差異，HPV16/18是宮頸癌發生最主要的亞型，占據約70%；HPV31/33/45/52/58占據約20%[10]。

2 hrHPV檢測技術及檢測結果與HC2的比較

2.1 HC2 HPVHC2是利用全基因組RNA探針與HPV DNA單鏈雜交，特異性抗體捕獲RNA-DNA雜合體，采用化學發光和信號放大的原理快速捕獲的檢測方法。該技術可檢測13種hrHPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)，是一種半定量方法[11]。HC2對實驗室無特殊要求，試驗數據重復性好，以hrHPV全基因組為靶點，可降低HPV整合引起的假陰性結果。然而，HC2檢測技術由于缺乏內對照，樣本中真菌乳膏等殘留導致的假陰性結果將會報告為陰性而非實驗無效[12]。hrHPV探針與低危型HPV(low-risk HPV，LrHPV)亞型存在交叉反應，HC2檢測的假陽性率高達18.8%[13]。

2.2 Cervista HPV HRCervista于2009年獲 得FDA批準，用于30歲以上婦女宮頸細胞學的聯合篩查，以及細胞學診斷為意義不明確的非典型鱗狀上皮細胞(ASC-US)患者的分型檢測。Cervista是基于酶切信號放大作用來檢測L1、E6、E7特定核苷酸序列的方法。與HC2相比，Cervista能夠檢測14種hrHPV，增加了基因型HPV66。該方法設有內部質控，避免了樣本量不足造成假陰性。然而，Cervista檢測與HPV67和HPV70存在交叉反應，導致結果出現假陽性[14]。該方法同樣存在HPV定量和分型問題。Cervista和HC2檢測結果比較發現，900名細胞學檢查均正常的女性，Cervista和HC2檢測的特異性分別為90%和96%，兩者的一致性為93%，Kappa值為0.5。在65例組織學判讀為CIN2+的女性中，Cervista和HC2檢測的特異性分別為91%和92%，兩者的一致性為95%，Kappa值為0.7[15]。

2.3 Cobas 4800 HPVCobas 4800利用Real-Time PCR技術檢測14種hrHPV，并可以明確識別基因型HPV16、HPV18。該技術已被批準用于25歲以上婦女的一線初篩。與HC2相比，Cobas 4800設有β-球蛋白內對照，實現了HPV DNA的定量檢測，而且HPV16和HPV18的特異性分型可以進一步對HPV陽性結果進行分類管理。耶魯大學醫學院的一項研究顯示，在1 371份標本中，HC2和Cobas 4800檢測的陽性率分別為11.38%、13.42%，其中94%的檢測結果一致，Kappa值為0.7。在1 371例病例中，兩種測定方法結果不一致的有82例(6%)。82例患者中27例(32.9%)為HC2陽性/Cobas 4800陰性，55例(67.1%)為Cobas 4800陽性/HC2陰性。大約有80%的HC2陽性/Cobas 4800陰性病例經Linear Array基因分型檢測為LrHPV陽性，而13.3%的Cobas 4800陽性/HC2陰性病例檢測為LrHPV陽性。該結果表明，Cobas 4800相比HC2對LrHPV的交叉反應性更低[16]。然而，英國的一項回顧性分析顯示，細胞學陰性的患者中Cobas 4800檢測的陽性率比HC2增加一倍，但臨床中CIN的檢出率沒有相應提高，可能是Cobas 4800設置的截斷值(Cut-off)低于HC2。當Cut-off提高時，Cobas 4800檢測結果的特異性升高[17]。

2.4 Aptima HPVAptima是FDA批 準 的 首 個HPV mRNA檢測方法，適用于30歲以上和細胞學診斷為ASC-US的21～29歲婦女。該檢測分為Aptima HPV和Aptima HPV16/18/45，Aptima HPV可以檢測14種hrHPV，Aptima HPV16/18/45可 以 分 型 檢 測HPV16、HPV18、HPV45。Aptima是基于轉錄介導的擴增技術定性檢測HPV E6/E7 mRNA，與HPV DNA相比，特異性更高，可以有效減少HPV一過性感染對檢測結果的干擾[18]。然而，Aptima檢測與LrHPV也存在交叉反應，但與HC2和Cobas 4800相比交叉反應率較低[14]。一項比較Aptima HPV和HC2的研究表明，兩者具有檢出CIN2+的敏感性和特異性相當，一致性為96.5%，Kappa值為0.7。然而，在細胞學異常或HPV持續感染12個月以上的患者中，Aptima HPV和Aptima HPV16/18/45檢測陽性的患者轉診陰道鏡的數量與HC2相比明顯減少[19]。另一項研究表明，423例細胞學異常的患者中，Aptima和HC2具有相似的敏感性，但HC2漏檢9例CIN2+患者，推斷Aptima可能更適用于宮頸癌初篩[20]。

2.5 Onclarity HPVOnclarity于2018年獲得FDA批準，用于宮頸癌的初篩。該系統是基于Real-Time PCR和熒光探針技術的自動化檢測系統，檢測HPV E6/E7 DNA區域。Onclarity以β-球蛋白作為內對照，能檢測13種hrHPV和疑似hrHPV66，并且可以提供6種基因型（HPV16、18、31、45、51和52）的分型檢測信息以及不同基因型組別（33/58、35/39/68、56/59/66）的檢測方案。有研究顯示，除HPV16、HPV18基因型外，其余高危基因型與CIN2+也有顯著相關性，尤其是持續感染一年或更長時間[21]。因此，Onclarity HPV分型檢測可以為隨訪患者感染的亞型提供持續監測，亦可應用于疫苗接種效果的評估。Onclarity對比HC2的研究顯示，兩者檢測結果的一致性為92%(150/163)，13個不一致的樣本包括4個HC2陽性/Onclarity陰性(3個CIN3和1個原位腺癌)、9個HC2陰性/Onclarity陽性(3個CIN1、6個CIN3和2個經Linear Array基因分型檢測也為陰性)[22]。

3 檢測結果的一致性分析

HPV初篩結果的一致性分析中，Cervista、Cobas 4800、Aptima和Onclarity與HC2對 比 發 現，檢 出CIN2+患者的敏感性和特異性相當。然而，一項針對30～65歲婦女的HPV初篩樣本顯示，4種不同檢測方法(HC2、Cobas 4800、CLART、Aptima)表現出顯著差異。在2 881例樣本中，23%的樣本至少有一種檢測方法呈陽性，其中僅42%～58%的樣本在所有檢測中均呈陽性，不同HPV檢測方法的分析設計差異可能是初篩結果不一致的主要原因[23]。另一項系統性分析同樣顯示HC2、Cobas 4800、Cervista、CLART、Aptima、Onclarity等不同檢測方法在初篩結果中表現出差異，大約有30%～50%陽性結果不一致[24]。HPV不同檢測方法初篩結果的不一致為宮頸癌篩查，尤其是HPV陽性、細胞學陰性的婦女帶來了巨大的挑戰。造成HPV初篩結果不一致的原因有很多，包括檢測技術的差異，如Real-Time PCR及探針法檢測的差異，引物的結合區域、檢測通量差異等；檢測目標的不同，如HC2、Cervista、Cobas 4800、Onclarity檢測HPV DNA，而Aptima檢測HPV mRNA；采樣部位的差異，有報道顯示基于信號放大原理的HPV檢測方法對陰道采集樣本敏感性和特異性較低，而PCR方法對陰道采集標本和宮頸采集標本敏感性和特異性相當[25]；檢測HPV亞型的差異等。針對初篩不一致的問題，建議采用hr-HPV檢測聯合其他方法篩查，HPV初篩陽性患者可進行細胞學檢測作為一次分流管理，細胞學陰性患者可間隔12個月重復hr-HPV檢測聯合細胞學篩查，亦可進行HPV16/18或p16/Ki67檢測作為二次分流管理。近幾年，甲基化標記物可用于宮頸癌篩查，研究顯示，與HPV檢測和p16/Ki67染色標記相比，甲基化標記物具有更高的特異性[26]。甲基化標志物在宮頸癌篩查中的應用日漸成熟也為HPV分流管理提供更多選擇。

4 討論

隨著HPV與宮頸癌發生關系的明確，宮頸癌篩查手段也逐漸發生變化，逐步由HPV檢測輔助細胞學檢查到與細胞學的聯合檢查，再過度到單一HPV初篩。最初，細胞學作為宮頸癌的主要篩查手段，宮頸癌的發病率和死亡率顯著下降。然而，細胞學檢測的缺陷也日益凸顯，細胞學檢測出現敏感度低、重復性差、假陰性率高等問題。此外，細胞學是一種主觀檢測方法，漏診率和假陽性率均較高，在資源落后的地區細胞學醫生很難滿足大范圍篩查的需求。P16和Ki-67雙染可以提供HPV陽性患者的分流，以及改善細胞學檢測的靈敏度。研究發現，與hr-HPV DNA檢測相比，P16/Ki-67雙染具有更高的特異性，但敏感性較低[27]。HPV檢測作為初篩方法具有穩定、自動化、高敏感性等優勢。大量研究表明，HPV檢測相比于其他篩查方法具有更高靈敏度和陰性預測值，并且可降低聯合檢測的復雜性和資源消耗[28]。然而，HPV初篩同樣也存在局限性，易造成陰道鏡的過度轉診，引起篩查者的恐慌。HPV非依賴性宮頸腺癌的篩查也為HPV初篩帶來巨大挑戰。此外，hr-HPV檢測的有效性是否因年齡、性生活史等存在差異仍需要深入探討。

一項按年齡分層比較hr-HPV初篩和細胞學篩查的研究表明，hr-HPV初篩結果顯示25～35歲女性CIN3+檢出率高于35歲以上女性；在25～65歲女性中，hr-HPV初篩的CIN3+檢出率高于細胞學篩查[29]。另一項年齡分層資料顯示25～29歲的女性檢出CIN3+的5年風險最高，50～64歲的女性最低[30]。雖然30歲以下女性hr-HPV陽性結果的風險較高，但在不同年齡組之間，不同篩查方法CIN3+檢測的一致性較好[29]。此外，由于20～25歲的年輕女性hr-HPV感染的持續性和進展率較低，幾乎在短時間內自然消退，很少發展成CIN2陽性。2020年，美國癌癥協會(ACS)篩查指南建議宮頸癌開始篩查的年齡為25歲，且HPV的一線篩查必須是FDA批準的可以用于一線篩查的HPV檢測方法Cobas 4800和Onclarity。由于FDA批準的一線HPV檢測方法尚未廣泛在臨床應用，故將聯合篩查和單獨細胞學檢查作為可接受的篩查方案。基于以上資料，建議HPV一線初篩可以選用Cobas 4800和Onclarity；聯合細胞學篩查，5種檢測方法均可。此外，一項研究報告顯示，在沈陽盛京醫院就診的15～30歲年齡組主要與HPV45感染有關，31～45歲年齡組與HPV33和HPV56感染有關，46～60年齡組與HPV16感染有關，HPV18在宮頸癌患者中感染率最高[31]。建議可以根據各地區流行的HPV感染型別、不同型別的多重感染等因素篩選合適的HPV檢測方法，Cevista、Cobas 4800、Aptima、Onclarity均具有分型優勢。宮頸病變患者HPV感染的流行病學調查及危險因素分析表明，初次性交年齡≤20歲、吸煙、流產次數＞1次是發生hr-HPV感染的獨立危險因素[32]。針對以上HPV感染率高的女性，建議HPV檢測聯合其他方法分流管理。

5 展望

宮頸癌是目前唯一病因明確，且可防治、可篩查、可治療的惡性腫瘤。隨著宮頸癌篩查技術的不斷提高，宮頸癌防治工作也取得相應進展。現有的宮頸癌篩查主要包括醋酸/碘染色肉眼觀察法、細胞學檢查、HPV檢測、p16/Ki67雙染色法等。醋酸/碘染色在欠發達地區是較為合適的篩查方法。細胞學檢查和HPV檢測均為宮頸癌篩查的有效手段。然而，病理醫師的匱乏與技術水平不一導致細胞學檢查的漏診率和誤診率均較高。近幾年，人工智能成為輔助細胞學檢查的新趨勢，提高了細胞學閱片的準確性與高效性，其在宮頸癌篩查中的作用還需臨床資料進一步確證。2018年，批準FDA認證的hr-HPV檢測應用于一線初篩，提高了篩查的敏感性。然而，與細胞學相比，hr-HPV檢測導致患者轉診陰道鏡的比例較高，檢查結果的異常更容易造成患者的心理壓力。如何平衡HPV檢測的敏感性和CIN2+患者檢出的特異性仍具挑戰。p16/Ki67雙染色法可分流hr-HPV陽性患者以及細胞學結果為ASC-US和低度鱗狀上皮病變(LSIL)患者，該方法可減少陰道鏡轉診率，是宮頸癌聯合篩查的潛在工具。隨著NGS技術應用于HPV檢測，以及DNA甲基化在宮頸癌篩查中的研究，這些技術將進一步完善HPV檢測，更有效地應用于宮頸癌的防治。