細胞焦亡與心肌缺血再灌注損傷及中藥單體干預研究進展

王益民，李焱，王怡斐，蘇文革*（.山東中醫藥大學 第一臨床醫學院，濟南 50000；.山東中醫藥大學附屬醫院，濟南 5004）

急性心肌梗死（AMI）是導致全球心血管疾病患者死亡的主要原因之一，目前通過及時有效的溶栓、經皮冠狀動脈介入（PCI）和冠狀動脈旁路移植術（CABG）等治療AMI 取得了巨大進展，缺血心肌的血運重建可恢復心肌功能，但也會產生額外的心肌損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷（MIRI）[1-3]。臨床上，MIRI 常發生在急性ST 段抬高型心肌梗死患者中，會造成心肌的炎癥反應、氧化應激、線粒體功能障礙、內質網應激、鈣超載等，引起心肌的二次損傷，增加心肌梗死面積，從而降低再灌注治療的獲益[1，4]。MIRI 的確切分子機制目前尚未完全闡明，也沒有有效的藥物來控制和預防。近年來研究表明，細胞焦亡與多種心血管疾病密切相關，如MIRI、動脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭以及冠狀動脈鈣化等[5]。其中細胞焦亡在MIRI 中具有重要作用，相關機制研究和藥物研究都取得了很大的進展，本文就細胞焦亡在MIRI 中的作用機制及中藥單體干預研究進行綜述。

1 細胞焦亡的分子機制

細胞焦亡是一種伴隨炎癥反應的程序性細胞死亡，其特征是gasdermin D（GSDMD）介導的膜孔形成、細胞腫脹和細胞溶解，并釋放大量的促炎介質，如白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18）等。細胞焦亡是一種非特異性先天免疫反應，不僅在抗病原微生物感染中發揮著重要作用，而且與眾多非病原微生物感染也密切相關[6]。

1.1 參與細胞焦亡的關鍵分子

細胞焦亡的發生涉及諸多分子的參與。先天免疫反應依賴于模式識別受體（PRRs）來識別病原體相關分子模式（PAMPs）和內源性損傷相關分子模式（DAMPs）。PRRs 家族主要包括NOD 樣受體（NLRs）、Toll 樣受體（TLRs）和C 型血凝素受體（CLRs）。炎癥小體在細胞焦亡中發揮著重要作用，參與細胞焦亡的炎癥小體主要有NLRs 家族、AIM2和Pyrin，其中NLRs 家族包括NLRP3、NLRP6 和NLRP9 等，以NLRP3 的相關研究最多[7-9]。Caspase家族是一類進化保守的半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞質中多以酶原（pro-caspase）形式存在，根據其功能和結構域，可以將caspase 家族成員分為炎性caspase 和凋亡性caspase[10-11]。在gasdermin 家族中，人類擁有gasdermin A（GSDMA）、gasdermin B（GSDMB）、gasdermin C（GSDMC）、GSDMD、gasdermin E（GSDME）和DFNB59，其中GSDMD在細胞焦亡中被廣泛研究，有“細胞焦亡的執行者”之稱[12-14]。

1.2 經典細胞焦亡途徑

經典細胞焦亡途徑是由caspase-1 介導的，在PRRs 接受到PAMPs 和DAMPs 刺激后，PRRs發生寡聚化，與凋亡相關的微粒蛋白（ASC）和pro-caspase-1 聚合形成炎癥小體，并激活caspase-1[13，15]。一方面，caspase-1 的激活使失活的IL-1β和IL-18 的前體裂解，產生成熟的IL-1β和IL-18；另一方面，激活的caspase-1 作用于GSDMD，并將其裂解為N 末端和C 末端產物，其中N 末端結構域是脂質選擇性的，可以在細胞膜上形成孔隙，釋放IL-1β、IL-18 等炎性細胞因子，從而引起細胞滲透壓變化，導致炎癥反應，并引起細胞膨脹、破裂、死亡[16]。

1.3 非經典細胞焦亡途徑

非經典細胞焦亡途徑依賴于caspase-11/4/5介導，不需要炎癥小體激活，可直接作為受體與脂多糖（LPS）等分子結合而激活，活化的caspase-11/4/5 通過切割GSDMD、釋放成熟的IL-1β和IL-18，從而誘導細胞焦亡的發生[17]。此外，活化的caspase-11/4/5 還可以通過Pannexin-1/ATP/P2X7 通路，介導NLRP3/ASC/caspase-1 活化，促進IL-1β和IL-18 成熟和釋放，誘導細胞焦亡的發生[18]。

1.4 其他細胞焦亡途徑

近年來研究發現，活化的caspase-3 可通過切割GSDME 并促進GSDME-N 結構域向細胞膜聚集，來誘導細胞膜孔隙的形成，從而導致細胞焦亡[19]。Caspase-8 對依賴于NLRP3 的caspase-1 通路起正向調節作用，還可以作為caspase-3 的上游蛋白或者直接切割GSDMD 或GSDME 來誘導細胞焦亡[20]。顆粒酶A 或B 可以取代caspase 的“傳統效應”，裂解gasdermin 蛋白家族，進而誘導細胞焦亡[21]。

2 細胞焦亡與MIRI

MIRI 的病理生理學涉及多種細胞的參與，如心肌細胞、心肌成纖維細胞、血管內皮細胞、間充質細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等[22]。根據最新的研究結果，心房區域含有約30.1%的心肌細胞、24.3%的心肌成纖維細胞和12.2%的血管內皮細胞；心室區域含有約49.2%的心肌細胞、15.5%的心肌成纖維細胞和7.8%的血管內皮細胞[23]。這三類細胞占整個心肌組織細胞總數的70%左右，深入了解這三類細胞在MIRI 中的焦亡機制，可為MIRI 的治療提供新方向。

2.1 細胞焦亡與心肌細胞

心肌細胞的炎癥和壞死在MIRI 的病理生理過程中起關鍵作用。根據最新的研究，心肌缺血再灌注可誘導心肌細胞焦亡，其中氧化應激是關鍵誘導因素，并主要通過caspase-11/GSDMD 信號通路來介導心肌細胞焦亡，這個過程伴隨著成熟的IL-18 的釋放，并且GSDMD基因敲除和GSDMD 抑制劑均可顯著減輕心肌細胞焦亡所致的心肌損傷[24]。有研究證明相關蛋白也可介導MIRI 中的心肌細胞焦亡的發生，如水通道蛋白4（AQP4）介導了MIRI 中心肌細胞焦亡，AQP4 抑制劑可通過抑制心肌細胞焦亡來減輕MIRI；甲基轉移酶樣蛋白3（METTL3）通過6-甲基腺嘌呤（m6A）修飾促進RNA 綁定蛋白DiGeorge 關鍵區域8（DGCR8）與pri-miR-143-3p 的結合，從而增強miR-143-3p 的表達，抑制蛋白激酶C-epsilon（PRKCE）轉錄，導致MIRI 中的心肌細胞焦亡[25-26]。這些研究提示抑制caspase-11/GSDMD 信號通路是治療MIRI 中心肌細胞焦亡的核心，未來的藥物研究可以該通路作為研究對象；多種相關蛋白也參與到了MIRI 中心肌細胞焦亡的發生，如AQP4 和METTL3 等，進一步探討這些蛋白對焦亡的調控機制，可為MIRI 的治療提供新靶點。

2.2 細胞焦亡與心肌成纖維細胞

心肌成纖維細胞是心肌組織中含量最豐富的非心肌細胞，它可以感知心臟損傷或應激時釋放的危險信號，在維持心臟正常功能方面具有重要作用[27]。在心肌缺血再灌注中可通過活性氧（ROS）產生和K＋外流介導心肌成纖維細胞中NLRP3 炎癥小體激活，誘導心肌成纖維細胞焦亡[28]。近年來研究發現，長鏈非編碼RNA GAS5（LncRNA GAS5）的DNMT1 沉默可以激活NLRP3 炎癥小體，導致心肌成纖維細胞焦亡，從而促進心肌纖維化的進展[29]。在心肌成纖維細胞中，環氧合酶-2（COX-2）參與了NLRP3 炎癥小體的激活，沉默COX-2基因或使用COX-2 抑制劑均降低了NLRP3 炎癥小體和下游細胞因子的表達和激活[30]。在缺氧/復氧（H/R）條件下，心肌成纖維細胞可分泌含有miR-133a 的外泌體，遞送到心肌細胞中，靶向ELAV 樣RNA 結合蛋白1（ELAVL1）并抑制心肌細胞焦亡[31]。由此可見，NLRP3 炎癥小體的激活是MIRI 時心肌成纖維細胞焦亡的關鍵，NLRP3 炎癥小體是MIRI 極具潛力的治療靶點。另外，進一步揭示心肌成纖維細胞在MIRI 時對心肌組織的自我保護機制，或許是未來的研究方向。

2.3 細胞焦亡與血管內皮細胞

血管內皮細胞對H/R 的變化極為敏感，其功能障礙是導致MIRI 的重要病理基礎之一。有研究表明，在H/R 誘導下，心肌微血管內皮細胞可發生焦亡，其機制與NLRP3/caspase-1 介導的IL-1β分泌有關[32]。在小鼠MIRI 模型中，自噬相關基因BECN1可以調節caspase-4 介導心肌微血管內皮細胞焦亡[33]。也有研究指出，抑制促炎因子的釋放、降低ROS 表達和抑制NLRP3 炎癥小體的激活，可降低心肌血管內皮細胞的焦亡水平[34]。血管內皮細胞損傷可再次導致冠狀動脈血管功能障礙，因此抑制MIRI 中血管內皮細胞損傷極具意義。抑制血管內皮細胞內的炎癥反應，降低ROS 水平，進而降低血管內皮細胞的焦亡水平，可減輕MIRI。

3 中藥單體對MIRI 中細胞焦亡的作用機制研究

3.1 黃酮類化合物

柚皮苷是存在于柚子皮、化橘紅、骨碎補等中藥材中的一種黃酮類化合物，研究發現柚皮苷具有抗炎、抗氧化應激、清除自由基等作用，對心腦血管疾病具有潛在的應用價值[35-36]。王婷婷等[37]研究發現，在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，柚皮苷低劑量（10 mg·kg－1）、中劑量（50 mg·kg－1）、高劑量（100 mg·kg－1）組心肌組織中caspase-1、NLRP3、ASC 以及GSDMD 蛋白的表達水平均比模型組降低，其發揮心肌保護作用與降低心肌組織的細胞焦亡水平有關。提示柚皮苷可通過抑制細胞焦亡進而減輕MIRI，但其抑制細胞焦亡的具體調控機制尚不清楚，有待進一步驗證。

芹菜素是存在于芹菜、車前子、絡石藤等中藥材中的一種黃酮類化合物，具有抗動脈粥樣硬化、抗高血壓以及抗自身免疫性心肌炎等多種藥理學作用[38]。Li 等[39]研究發現在缺血/缺氧（I/H）處理的大鼠心肌細胞（H9C2 細胞系）模型中，芹菜素可呈劑量依賴性降低NLRP3、caspase-1、GSDME-N、IL-1β和IL-18 的表達水平，其發揮心肌保護作用可能與抑制心肌細胞焦亡有關。然而芹菜素抑制MIRI 中細胞焦亡的具體作用機制還需進一步研究。

木犀草素是存在于野菊花、金銀花、紫蘇葉等中藥材中的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗高血壓和心臟保護等作用[40]。Zhang 等[41]研究發現在雄性SD 大鼠MIRI 和H/R 處理的H9C2 細胞系模型中，木犀草素有效地抑制了心肌細胞中NLRP3、ASC、caspase-1、Toll 樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）的表達，其心肌保護機制也可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 通路介導的細胞焦亡有關。體內外實驗均顯示木犀草素對MIRI 具有較強的心臟保護作用，未來可進一步探索其臨床應用價值。

3.2 萜類化合物

獐牙菜苷是從龍膽科植物獐牙菜中提取的一種環烯醚萜類化合物，具有強大的抗氧化和抗炎活性[42]。Li 等[43]研究發現在雄性Wistar 大鼠MIRI 和H/R 處理的H9C2 細胞系模型中，獐牙菜苷能抑制Kelch 樣ECH 相關蛋白1（Keap1）并誘導核因子E2 相關因子2（Nrf2）核易位，降低NLRP3、ASC、caspase-1 和IL-1β的表達水平，能顯著抑制心肌細胞焦亡，并發現通過抑制Nrf2 的表達可以消除其對心肌細胞焦亡的抑制作用，推測獐牙菜苷可能通過調節Keap1/Nrf2 軸抑制細胞焦亡，進而發揮心肌保護作用。研究還發現，獐牙菜苷對心肌細胞焦亡的抑制作用部分受Keap1/Nrf2 軸的調節，這表明還有其他途徑參與了抗焦亡作用，尚需要進一步的實驗來確證其抗焦亡作用的最強或最具潛力的途徑[43]。

3.3 香豆素類化合物

秦皮甲素是從中藥秦皮中提取的一種香豆素類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗血栓形成等多種藥理學作用[44]。Xu 等[45]研究發現在雄性SD 大鼠MIRI 和接受氧氣-葡萄糖剝奪/恢復（OGD/R）處理的新生大鼠心肌細胞（NRCM）模型中，秦皮甲素可通過AKT/GSK3β/NF-κB 通路抑制NLRP3 炎癥小體介導的細胞焦亡，從而減輕MIRI 和OGD/R 誘導的心肌細胞損傷。同時還發現秦皮甲素（30 mg·kg－1）治療組在減輕再灌注心律失常、心肌損傷和恢復血流動力學功能方面與硝苯地平（10 mg·kg－1）治療組沒有明顯差異，這些結果證實了秦皮甲素可有效減輕MIRI，是極具前途的治療MIRI 的候選藥物。

3.4 醌類化合物

大黃素是從中藥大黃根莖中提取的一種蒽醌類化合物，具有抗炎、抗氧化、免疫調節、抗纖維化等藥理作用，在心血管疾病方面具有極大的應用潛力[46-47]。Ye 等[48]研究發現，在雄性SD 大鼠MIRI 和H/R 處理的心肌細胞模型中，大黃素可減少心肌細胞中ROS 的產生，降低TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3 和GSDMD-N 的表達，進而抑制心肌細胞焦亡，其作用是通過抑制TLR4/MyD88/NFκB/NLRP3 通路實現的。提示大黃素是治療MIRI的候選藥物，TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 通路可能包含MIRI 的重要治療靶點。然而，大黃素介導的肝腎等器官毒性的細胞和分子機制仍不明確，還需要進一步研究其臨床應用價值[49-50]。

3.5 生物堿類化合物

胡椒堿是存在于黑胡椒和長胡椒中的一種生物堿類化合物，現有研究已經證實其具有抑制心肌纖維化、減少線粒體氧化應激、清除ROS 以及擴張血管等諸多心臟保護作用[51]。Guo 等[52]研究發現在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，胡椒堿可降低心肌組織的細胞焦亡水平，其機制與胡椒堿抑制了miR-383 的表達和促進RP105/PI3K/AKT通路的激活有關，并提示miR-383 通過RP105/PI3K/AKT 依賴的方式調節MIRI 中的細胞焦亡。miRNA 是一種高度保守的非編碼RNA，可通過直接結合3' UTR 來抑制靶mRNA，從而導致心肌細胞焦亡和MIRI[53]。胡椒堿可通過調控miRNA，進而抑制MIRI 中的細胞焦亡，為我們從miRNA角度研究細胞焦亡和MIRI 之間的關系以及藥物作用機制提供了思路。

3.6 酚類化合物

丹皮酚是從毛茛科植物牡丹的根皮中提取的一種酚類化合物，具有抗動脈粥樣硬化、保護血管內皮細胞、保護心肌細胞以及抑制心肌纖維化等多種藥理學作用[54]。丁華勝等[55]研究發現在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，丹皮酚預處理可呈劑量依賴性地抑制TLR4 的表達及核轉錄因子NF-κB的活化，降低NLRP3/ASC/caspase-1 介導的心肌組織的細胞焦亡水平，減輕MIRI。丹皮酚作為治療心血管疾病極具潛力的候選藥物，未來可結合臨床試驗進一步評價其在MIRI 中的治療價值。

3.7 有機酸類化合物

肉桂酸是從中藥肉桂皮中提取的一種有機酸類化合物，具有廣泛的藥理學作用，如抗氧化、抗炎、心臟保護、神經保護等，對心血管疾病具有潛在的治療作用[56-57]。Peng 等[58]研究發現在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，肉桂酸能抑制MIRI 后大鼠心肌的炎癥反應，減輕心肌損傷，縮小心肌梗死面積，改善心功能，其機制主要表現為下調NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1 和GSDMD-N 蛋白的表達，顯著抑制心肌組織中NLRP3 炎癥小體的激活和隨后的心肌細胞焦亡。提示肉桂酸可通過抑制心肌細胞焦亡來減輕MIRI，并具有良好的心肌保護活性，但其治療和預防MIRI 的能力尚需要進一步的系統評價和臨床試驗來驗證。

3.8 苷類化合物

天麻素是從中藥天麻中提取的一種糖苷類化合物，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等多種藥理學作用，廣泛應用于心腦血管疾病的治療[59-60]。Sun 等[32]研究發現在雄性C57BL/6J 小鼠MIRI 和H/R 處理的人心臟微血管內皮細胞系（HCMECs）模型中，天麻素可通過抑制NLRP3/caspase-1 信號通路，降低心肌組織和HCMECs 的焦亡水平，減少炎性細胞浸潤，具有心肌保護作用。由此可見，天麻素可通過抑制經典細胞焦亡途徑發揮心肌保護作用，然而天麻素調節細胞焦亡的深層分子機制還需進一步探索。

4 小結與展望

細胞焦亡是MIRI 的重要機制之一，從細胞焦亡角度探討MIRI 的治療或許是一個潛在策略[61]。雖然目前還沒有開發出治療MIRI 的特異性藥物，但中藥單體中多種天然化合物均顯示出抗MIRI 活性，為尋找特異性抗MIRI 的藥物提供了選擇。多種中藥單體抗MIRI 已經進行了大量的基礎研究，在發揮抗炎、抗氧化應激、抑制鈣超載、調節心肌能量代謝、改善血管內皮功能以及調節線粒體功能等方面具有重要作用[62]，但目前臨床推廣極少，也導致其實用價值下降。藥物制劑的創新或許有利于藥物的臨床推廣，可以考慮將中藥單體與納米藥物遞送系統相結合[63]，在臨床試驗中以提高藥物靶向性，并減少不良反應。

結合目前的研究，多種中藥單體的體內外實驗均顯示出抗MIRI 中細胞焦亡活性，為下一步開發治療MIRI 的特異性藥物奠定了堅實基礎。但我們仍然可以看到以下不足：

① 機制研究不深入：目前的研究多是基于聚合酶鏈式反應（PCR）和蛋白質印跡法（Western blot）來檢測基因或蛋白表達的層面，未來可利用基因敲除或抑制關鍵蛋白等研究來驗證中藥單體的作用靶點，還可利用分子對接技術等結構藥理學方法揭示中藥單體的結合位點，進一步闡明中藥單體的具體作用機制。

② 模型構建待改進：由于MIRI 特定的發病狀態，體外實驗模型構建存在一定的難度。目前OGD/R、H/R 等造模方式缺乏神經體液調節，并不能完全模擬MIRI 期間的病理生理變化，可能會對實驗結果造成一定的偏差。未來的研究可進一步改進實驗模型，并選擇公認的模型進行實驗研究。

③ 藥理研究不完善：除了完善對中藥單體的藥物效應動力學研究外，還應進一步研究藥物代謝動力學以及藥物毒理學等內容，完善對中藥單體的藥理學研究。

④ 臨床試驗尚缺乏：目前對中藥單體的研究多是基于細胞實驗和動物實驗，尚未有臨床試驗的證據支持，未來還需要進一步的臨床試驗來證明中藥單體的安全性和有效性。

總之，中醫藥在治療MIRI 中顯示出巨大的應用潛力，雖然目前仍處于基礎研究階段，還存在諸多問題需要解決，但我們應開拓研究思路，進一步結合新技術、新方法，開發治療MIRI 的新藥物。