心磷脂外化在創傷性腦損傷中的研究進展

牛 曼,王樹洪,熊彬媛,姜興宇,李玉林,劉婷婷,喻安永

遵義醫科大學附屬醫院急診科,貴州 遵義 563003

創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)不僅嚴重危害患者健康，而且給家庭和整個社會造成巨大負擔，從全世界范圍來看，每年有超過5 000萬人發生TBI，而中國TBI患者的總人數遠超其他大多數國家[1]。盡管多年的基礎研究已經開發出一些有前景的神經保護療法，但均未能轉化到臨床，而且目前尚無有效的藥物[2]。線粒體自噬(mitophagy)是細胞通過選擇性自噬清除功能異?；蚨嘤嗑€粒體的過程，它可以維持線粒體質量及功能的穩定，從而在TBI中發揮神經保護作用[3]。在哺乳動物中，已經鑒定出了不同的線粒體自噬效應因子，如類NIP3蛋白X(NIP3-like protein X,Nix)、Bcl-2/腺病毒E1B19-KDa-相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa-interacting protein3,BNIP3)、攜帶FUN14結構域蛋白1(FUN14 domaincontaining protein 1,UNDC1)、Bcl-2類蛋白13(BCL2-like 13,BCL2L13)、心磷脂(cardiolipin,CL)和PTEN誘導激酶1(PTEN-induced kinase 1,PINK1)等[4]。Chao等[5]首次證明在人類和大鼠的受傷大腦中，CL外化介導的受損線粒體的靶向自噬參與了TBI早期受損細胞器的清除。因此對CL外化的進一步研究，可能是改善TBI治療結果的潛在策略。

1 CL的概念

CL是線粒體特異性磷脂，具有獨特的二聚體結構，含有4個酰鏈和2個與甘油相連的磷脂?；鵞6]。CL在線粒體內膜(inner mitochondrial membrane，IMM)的基質側合成[7]，幾乎只存在于線粒體膜內，占所有磷脂的20%。CL的功能體現在多個方面：線粒體膜的構造、蛋白質的引進、生物能量、線粒體動力學和線粒體自噬[8]。所以CL代謝的缺陷會導致線粒體結構的改變，包括嵴的喪失、氧化磷酸化降低、線粒體DNA不穩定、線粒體形態和動力學改變及線粒體自噬能力的降低[9-11]。TBI增加了大腦能量需求，導致線粒體呼吸鏈激活，進一步使活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成增加，這一系列事件通過氧化CL來觸發神經元凋亡。神經細胞避免凋亡的一個途徑是通過線粒體自噬消除受損的線粒體，研究結果表明，TBI后由CL引導的線粒體自噬是一種內源性的神經保護過程，標志著受損的線粒體被消除，從而限制神經元死亡和行為缺陷[5]。

2 CL引導的線粒體自噬在TBI后的神經保護作用

2.1CL過氧化促進細胞凋亡 TBI后大腦能量需求增加，線粒體呼吸被激活，從而導致ROS生成增加，此時CL被氧化，導致細胞凋亡，使神經細胞功能喪失，進一步加重顱腦損傷[5]。這個氧化過程是CL與細胞色素c(Cytochrome C，Cytc)相互作用實現的。Cytc是一個定位于線粒體膜間隙的水溶性蛋白質，是在呼吸鏈中電子傳遞必需的一類色素蛋白，其參與呼吸作用。另一方面，膜結合的Cytc已被確定為細胞凋亡的活化劑[12]。CL與Cytc相互作用形成過氧化物酶復合物，催化CL過氧化，過氧化的CL在OMM上的聚集導致Bcl-2相關X蛋白(Bax)的募集和線粒體通透性轉換孔(MPTP)的形成，MPTP將包括Cytc在內的線粒體促凋亡蛋白釋放到細胞質中，在細胞質中，Cytc促進凋亡體組裝，從而觸發細胞凋亡[13-14]，進一步導致神經細胞的功能喪失，從而加重顱腦損傷。CL是唯一在凋亡過程中發生過氧化的線粒體磷脂，它與Bcl-2家族蛋白相互作用，使線粒體外膜通透性增加，導致Cytc的釋放[15]。研究證實，對乙酰氨基酚可以減少CL的過氧化，最大限度地減少細胞凋亡[16-17]，且對乙酰氨基酚可以誘導CL重塑[18]。研究發現核糖體生物發生因子Peter Pan(PPAN)的缺失會導致自噬途徑和細胞凋亡的失衡[19]。向線粒體輸送小分子抑制劑、電子清除劑，既可以防止大量心磷脂氧化產物的積累，也可以防止顱腦損傷[20]。截短型Bid基因(T-Bid)可能與Cytc競爭CL，導致Cytc從膜上釋放，從而停止CL的氧化[21]。含有C22∶6的CL是TBI后引起的氧化損傷的一個特異的、早期的和顯著的靶點，提示CL氧化產物可能是腦內細胞早期凋亡的生物標志物信號，也是急性治療的關鍵靶點[22]。Kagan等[6]表示氧化反應可能通過導致線粒體損傷和氧化脂質的積累來間接促進線粒體自噬。通過對CL過氧化導致細胞凋亡的機制的研究，可能找到治療TBI的有效治療靶點。

2.2CL外化到線粒體表面作為消除信號引起線粒體自噬 Erlich等[23]首先證明自噬在TBI中起保護作用。Chao等[5]首次證明在受傷的人類和大鼠的大腦中，線粒體自噬參與了TBI早期受損細胞器的清除，CL外化到線粒體表面，作為受損線粒體清除的標志物，誘導線粒體自噬清除受損線粒體，從而抑制細胞凋亡，這一系列過程減輕了神經元細胞的死亡和相關的行為缺陷。

2.2.1CL與核苷二磷酸激酶D(NDPK-D)結合外化:NDPK-D或NME4(非轉移性表達的異構體4)，也被稱為NM23-H4，是形成定位于線粒體膜間間隙的大的同源六聚體復合物[24]，其結合CL并促進其重新分布到線粒體膜外膜[25-26]。NDPK-D通過在膜間隙形成六聚體，在物理上連接IMM和線粒體外膜(outermitochondrial membrane，OMM)，所以NDPK-D可能在物理上促進CL從IMM外化到OMM[6]。視神經萎縮1(optic atrophy l，OPA1)是IMM融合和嵴形成所必需的GTPase蛋白，OPA1與某種蛋白相互作用參與將NDPK-D的激酶功能轉換為CL-轉位酶活性[25]，促進CL從IMM到OMM的轉位。由于NDPK-D具有產生核苷三磷酸鹽和促進CL轉移的雙重功能，并且與OPA1緊密結合，通過OPA1為其提供GTP，因此NDPK-D是一個決定線粒體自噬反應的十分關鍵的整合位點[27]。此外，CL還與其他線粒體自噬相關的蛋白相互作用。例如，自噬相關蛋白Beclin 1直接與OMM上的CL結合，以誘導或抑制線粒體自噬[28]。心磷脂酰基轉移酶1(Acyl-CoA:lysocardiolipin acyltransferase-1,ALCAT1)可以在多種衰老相關疾病中催化CL的病理重塑[29]，去除ALCAT1顯著增強了線粒體自噬的吞噬作用[30]。Tafazzin蛋白(TAZ)是一種CL重塑轉?；?，在不影響自噬小體生物發生的情況下調節線粒體功能和線粒體自噬的功能[31]。研究發現，卡路里限制(calorie restriction，CR)促進廣泛的線粒體膜重塑，降低氧化損傷的脂質，增加心磷脂水平和重新分配心磷脂[32]。綜上所述，對CL外化相關蛋白的研究，可能發現新的藥物靶點，從而調節線粒體自噬，進一步減輕腦損傷。

2.2.2CL與線粒體肌酸激酶(mitochondrial creatine kinase，mtCK)相互作用外化:mtCK與含有心磷脂的膜具有高親和力。mtCK在線粒體中含量非常豐富，占線粒體蛋白質的1%，它是一種多任務蛋白，定位于線粒體膜間間隙，是跨越線粒體膜的八聚體，與CL特異性結合[33]。當CL異常時，mtCK不能作為轉運體發揮作用，這表明CL對于mtCK的穩定有重要作用[21,34]。mtCK可能通過膜脫水導致線粒體膜界面水的丟失，從而促進脂質轉移[21]。mtCK通過磷酸肌酸穿梭機制參與線粒體和胞漿之間的能量轉移，并且在維持線粒體膜結構方面具有額外的作用[33]，它還調節線粒體通透性轉換孔，其氧化會破壞能量平衡，膜通透性轉換孔打開，從而導致細胞凋亡[35]。mtCK 和NDPK-D非常相似[21]，這兩種激酶都具有兩種功能，即通過強的心磷脂相互作用與內膜ANT和線粒體呼吸的功能偶聯，以及膜間脂質轉移，它二者可能有相同的CL從IMM到OMM的轉位方式。CL通過NDPK-D和mtCK從線粒體內膜外化到線粒體外膜，然后與微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1light chain 3，MAPlLC3/LC3)相互作用介導線粒體自噬過程。

2.2.3CL外化與LC3結合:CL外化到線粒體表面可以促進線粒體自噬。Chu等[36]發現，在初級皮質神經元和SH-SY5Y細胞中，魚藤酮、星孢素、6-羥基多巴胺可以導致心磷脂外化到線粒體表面。CL從從線粒體內膜轉運到線粒體表面，至少需要3次移位：(1)從IMM的內小葉到OMM的外小葉;(2)從IMM的外小葉到OMM的內小葉;(3)從OMM的內小葉到OMM的外小葉[37]。這一過程涉及磷脂擾亂酶3(phospholipid scramblase-3，PLS-3)，負責CL從IMM到OMM的移位并伴隨自身的磷酸化，PLS3缺乏通過抑制CL外化減弱TBI誘導的線粒體自噬[5]。

因線粒體損傷而外化的CL與自噬蛋白LC3相互作用，介導初級神經元和轉化的神經細胞中線粒體的靶向自噬[36]。LC3是自噬標志物，自噬信號誘導后，胞漿型LC3(即LC3-I)與磷脂酰乙醇胺共價脂化形成膜相關的LC3-II，自噬的“貨物”受體將“貨物”帶入正在形成的吞噬體，并通過LC3相互作用區(LIR)域與LC3結合，最終形成自噬體[38]。最新研究表明，TBI誘導的線粒體自噬，通過CL外化作為消除受損線粒體的標志物是有益的，因為它減輕了神經元死亡和相關的行為缺陷[5]。CL的重新分布是線粒體自噬的信號，它通常定位于線粒體膜內，當存在線粒體損傷、去極化和其他損傷信號時，很大一部分CL移位到線粒體膜外表面，在OMM表面形成了一個重要的平臺，在那里CL與存在于吞噬體上的酵母中自噬相關基因8(Atg8)的同源物-LC3的特定位點(幾個堿性氨基酸簇)結合，促進炎性小體的激活，并刺激線粒體通過線粒體自噬來清除受損或無功能的線粒體[36,39-40]。LC3將同時介導線粒體識別和自噬小體的形成，最終導致受損線粒體的移除[41]。線粒體自噬對于神經元細胞來說是一把“雙刃劍”，LC3結合位點有一個重要特征，它可以被cAMP依賴的蛋白激酶PRKACA/PKA (protein kinase,cAMP-dependent,catalytic,α)磷酸化，該位點靠近一對精氨酸，用于線粒體自噬。Chu等[40]預測通過在這個區域增加負電荷，將有助于減弱LC3與CL的結合作用，從而提高觸發線粒體自噬的閾值。值得注意的是，LC3介導的CL識別不依賴于氧化，非氧化性CL的外化足以觸發線粒體自噬。CL過氧化，導致持續的傷害或過量的ROS產生，可能有助于將CL相關的線粒體信號從線粒體自噬轉變為細胞程序性死亡[40]。CL過氧化導致細胞凋亡，而細胞避免凋亡的途徑包括CL外化引導的線粒體自噬，或許通過對線粒體不同生理狀態下的研究，可以發現TBI有效的治療靶點。

3 總結與展望

盡管近年來實驗性研究已經開發出了一些可能有效的神經保護療法，但是在臨床的實際應用仍無進展，科研工作者和臨床醫師都在積極探尋有效的治療方法。本篇總結了和CL外化引起線粒體自噬有關的幾種相關蛋白，針對這種脂質-蛋白質的相互作用的研究，可能為未來的研究提供一種新方向。CL既參與線粒體自噬又在神經細胞凋亡中發揮重要作用，所以對CL的進一步研究可能為TBI提供有效治療靶點。關于線粒體脂質的研究已經取得了許多進展，但CL外化的具體機制仍需進一步探究，并且對正常CL代謝的途徑還知之甚少。因此，通過對CL的進一步研究，可能會在TBI治療方面發掘無限潛能。

作者貢獻聲明:牛曼：選題設計，文章撰寫；喻安永：提供研究經費與指導性支持；王樹洪、熊彬媛、姜興宇、李玉林、劉婷婷：整理文獻以及采集整理數據