MSCs-Exo對創面愈合炎癥反應的調控作用及機制研究進展*

王文瑞，黃曉飛，孫田靜 綜述，喻安永審校

(遵義醫科大學附屬醫院急診科，貴州遵義 563000)

創面愈合是指致傷因子的作用造成組織缺失后，局部組織通過再生、修復、重建，進行修補的一系列復雜而有序的生物學過程，受多層面、多因素調控，是針對組織細胞損傷的一種固有防御性反應[1]。皮膚損傷后，受損區域皮膚組織會進入一個動態的、高度可控的恢復過程，主要包括止血、炎癥、增殖和組織重塑4個連續交織的階段[2]。如果愈合過程不順利，急性皮膚創面在3個月內無法通過正常、有序、及時的修復過程達到解剖和功能上的完整性，將演變為慢性皮膚創面[3]。炎癥反應及瘢痕形成均為創面愈合的必經過程，其中炎癥反應有助于清除創面壞死物質，促進細胞生長因子釋放，而瘢痕形成則有助于盡早關閉創面，縮短創面愈合時間，二者共同促進創面修復[4]。有研究證實，慢性創面難愈可能與過度且持續的異常創面炎癥密切相關，通過炎癥反應抑制干預可有效改善創面局部炎癥刺激，提高潰瘍面愈合效果，并加快愈合進程[5]。創面炎癥干預已成為慢性難愈合創面治療研究的重要靶點之一，為此學界嘗試了許多方法，并始終在尋找更有效的解決方法。近年來，間充質干細胞(MSCs)及MSCs源性外泌體(MSCs-Exo)等在創面修復中的應用受到了廣泛的關注，可有效修復創面并有效減輕創面異常炎癥反應，促進創面愈合。本綜述對創面愈合過程進行介紹，分析MSCs-Exo調控創面炎癥反應的機制，歸納和總結MSCs-Exo減輕創面異常炎癥反應、促進創面愈合的研究現狀，為MSCs-Exo未來臨床應用于創面修復治療和研究提供參考。

1 創面愈合過程

創面愈合是一個動態又復雜的生理過程[6]。在止血期，創面局部血管收縮，血流量減少，內源性及外源性凝血過程啟動，血小板聚集于裸露的膠原纖維上，釋放5-羥色胺、前列腺素、磷脂和二磷酸腺苷(ADP)等血管活性物質，吸引更多的血小板聚集，加速血凝塊形成，此時凝血過程完成。進入炎癥期，隨著一氧化氮、白細胞介素(IL)等炎癥物質釋放，早期收縮的血管擴張，粒細胞和巨噬細胞游出血管向創面趨化，吞噬入侵的細菌，消化壞死的組織細胞碎片，同時，組織細胞溶酶體釋放蛋白溶酶加速消化過程，使創面清潔，以啟動組織的修復過程。進入創面增殖和組織重塑階段，巨噬細胞刺激成纖維細胞增殖分化，合成膠原蛋白，毛細血管和結締組織的反應性增生形成肉芽組織，并在生長因子[如血小板衍生性生長因(PDGF)]作用下不斷成熟，填充創面基底部，同時創面周緣健存的基底細胞開始增生，并向中心部位移行，使創面不斷縮小。當創面被再生的上皮細胞完全覆蓋后，內部膠原纖維重新排列，毛細血管數目減少，創面局部顏色減退，在結締組織收縮作用下完全合攏，組織層次恢復正常，創面得以愈合。

2 創面愈合過程炎癥反應

創面炎癥反應持續時間及程度與創面大小、創傷機制、局部血供、創面治療措施是否及時有效等因素有關，早期創面清創、植皮，調控異常炎癥，治療原發病，改善機體全身狀態均有助于創面修復痊愈[7]。研究顯示，炎癥反應期延長可引起創面微環境變化，進而延緩創面愈合[8]。創面愈合早期，免疫應答反應有助于清除病原體，但是，過度且持續的炎癥反應將促進慢性創面的形成，加速肥厚性瘢痕的產生，炎性組織中性粒細胞及巨噬細胞持續及過度浸潤，受體[如Toll樣受體(TLR)]過度激活，IL-6、IL-17、IL-8、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子持續過度表達，大量促炎細胞因子和蛋白酶持續作用可引起組織血管過度收縮，導致血供障礙及組織損傷，同時血管內皮細胞生長因子(VEGF)、PDGF、轉化生長因子(TGF)-β等生長因子水平降低，有氧自由基生成過多、鈣離子超載等因素均可導致愈合進程停留在炎癥反應期，抑制創面修復[9]。在增殖與組織塑形階段，炎癥異常持續可引起創面基質金屬蛋白酶(MMP)活性增加、蛋白酶組織抑制物減少，成纖維細胞老化、纖維連接蛋白變性與碎片化，導致細胞外基質(ECM)過量破壞并阻礙肉芽組織形成，抑制上皮組織的修復，因此早期調控創面異常炎癥反應顯得格外重要[10]。

3 MSCs-Exo創面修復研究現狀及對異常炎癥反應調控作用

3.1 MSCs-Exo創面修復領域的研究現狀

MSCs作為人體組織重要的組成成分之一，可來源于骨髓、脂肪、臍帶等多種組織，現已廣泛用于創面修復、腦損傷等疾病治療。移植后的干細胞存活數量隨時間的推移急劇下降，極少量存活的干細胞并不能從根本上影響新生組織的再生構建，更有可能是通過局部微環境的改變而產生作用[11]。有研究證實，MSCs-Exo既保留MSCs的功能特性，同時又具有更低的免疫原性與更高的安全性，目前已廣泛用于神經退行性疾病、脊髓損傷、骨性關節炎、糖尿病潰瘍創面等疾病研究及治療[12]。MSCs-Exo直徑30～100 nm，具有脂質雙分子層結構，可由差速離心、沉淀、免疫分離等方法提取，并通過釋放蛋白、脂質、核酸等生物活性物質，構成細胞間信號傳遞系統[13]。 MSCs-Exo在不同階段分別參與炎癥反應調控，促進創面愈合，抑制瘢痕的形成。MSCs-Exo最大限度保留了MSCs損傷修復、炎癥抑制、免疫調節的作用，在創面修復中顯示出了極大的潛力，同時具有更長的半衰期、更低的免疫原性、更好的穩定性，一方面可以直接作用于創面，促進表皮細胞遷移、增殖和血管形成，增加生長因子的表達，另一方面具有免疫調節、免疫抑制和抗炎作用，對創面異常炎癥反應進行調控，加速創面愈合[12]。

3.2 MSCs-Exo對創面修復異常炎癥反應的調控作用

3.2.1MSCs-Exo對巨噬細胞及炎癥因子的調控作用

炎癥初期，創面局部微環境誘導巨噬細胞向M1型轉變，巨噬細胞分泌的CXCL9、CXCL10等趨化因子吸引中性粒細胞聚集，并釋放IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子促進創面炎癥發生，清除壞死組織并防止細菌侵襲[14]。進入增殖及組織重塑階段，巨噬細胞轉變為M2型，通過分泌產生IL-10、TGF-β等抗炎因子抑制炎癥反應持續，促進創面修復[15]。若M1型巨噬細胞不能及時向M2型轉化，持續的炎癥信號將建立正反饋環，放大炎癥反應效應，使創面滯留在炎癥反應期，影響創面愈合[16]。MSCs-Exo通過Janus激酶-信號轉導通路、微RNA(miR)-146a、miR-9、miR-127、miR-155和miR-125b等途徑有效促進巨噬細胞向M2型轉化，縮短炎癥反應時間，同時通過Notch信號通路和核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信號軸減少TNF-α、IL-1α、IL-6等炎癥因子分泌，增加IL-10、TGF-β、CCL1等抗炎因子分泌，并抑制核因子-κB(NF-κB)和p38絲裂素活化蛋白激酶(p38-MAPK)信號通路，減少巨噬細胞活化，調節創面M1/M2型巨噬細胞比例，減少炎癥因子釋放，促進創面修復[17-19]。

3.2.2MSCs-Exo對中性粒細胞及炎性因子的調控作用

創面局部血液循環障礙、壞死組織形成、趨化因子大量釋放均可誘導中性粒細胞活化，促使中性粒細胞靶向損傷部位釋放氧自由基，蛋白水解酶發揮抗感染及保護創面作用，同時刺激成纖維細胞、上皮細胞等細胞增殖，增加血管通透性，分泌促炎細胞因子(如IL-17)和生長因子(如VEGF)，形成對中性粒細胞及巨噬細胞等持續募集和激活[20]。若炎癥持續，上述反應加重組織損傷，導致創面局部循環障礙，加速炎性損傷的發生，使創面加深和擴大，有研究表明早期應用氧自由基清除劑及蛋白酶抑制劑可有效促進創面愈合[21]。MSCs-Exo通過抑制C5b-9復合物的形成，有效減少中性粒細胞浸潤及IL-17釋放，減輕創面局部炎癥反應，并通過抑制TNF-α、IL-1β、金屬蛋白酶的基因表達及釋放，促進M2型巨噬細胞的生成，增強巨噬細胞對局部中性粒細胞的吞噬作用，釋放miRNA(如miR-1 24-3p)片段，使創面局部釋放的炎癥因子及中性粒細胞數量減少，避免過多中性粒細胞趨化與活化所致創面損傷，促進創面愈合[22-24]。

3.2.3MSCs-Exo對淋巴細胞、肥大細胞及炎性因子的調控作用

創面局部巨噬細胞或樹突狀細胞將抗原信息呈遞給CD4+T淋巴細胞，激活輔助性T淋巴細胞(Th)2，誘導成纖維細胞增殖分化及遷移，釋放IL-4、 IL-5、IL-10、IL-13等炎癥因子和促纖維化因子，加速ECM合成與沉積，影響膠原代謝，加速病理性瘢痕的形成[25]。同時，損傷局部血管導致大量T淋巴細胞滲出，釋放干擾素及促炎介質影響成纖維細胞增殖活性和膠原的沉積，延緩創面愈合并促進瘢痕形成[26]。損傷局部聚集的肥大細胞可釋放TGF-β、PDGF等促纖維化因子及組胺、類胰蛋白酶等細胞質顆粒，刺激成纖維細胞增殖，促進肌成纖維細胞的合成及膠原合成，延緩急性炎癥反應并促進瘢痕形成[27]。肥大細胞過量聚集、活化對缺血性皮膚傷口的張力產生負面影響，并通過釋放擴血管物質(如組胺)導致出血，抑制凝血過程，延緩創面愈合[28]。MSCs-Exo通過傳遞抗原、miRNA等多種物質，抑制樹突狀細胞的活化并誘導耐受，調節創面免疫平衡，同時可通過增強程序性死亡配體-1(PD-L1)、galecin-1和TGF-β的基因表達，抑制自身反應性淋巴細胞增殖，抑制B淋巴細胞的分化及炎癥作用，加速活化T淋巴細胞的凋亡，減少Th17和Th22的生成，促進Th1轉化為Th2，上調自身反應抑制性淋巴細胞比例，誘導免疫耐受，減少干擾素-γ(IFN-γ)、TNF-α、IL-1β等炎癥因子的表達，增加IL-6、IL-10、TGF-β等抗炎細胞因子分泌，有效抑制創面免疫反應，加速創面愈合[29-32]。同時MSCs-Exo可降低血清免疫球蛋白E(IgE)水平，減少嗜酸性粒細胞及肥大細胞活化，減少IL-4、IL-23、IL-31和TNF-α炎癥因子的表達和組胺等物質的釋放，縮短凝血過程，促進創面愈合及預防瘢痕形成[33]。

3.2.4MSCs-Exo對成纖維細胞及血管生成的調控作用

慢性創面通常伴隨組織缺失及局部血液循環障礙，常引起炎癥持續，導致創面延遲愈合或不愈。若皮下組織長期暴露可促進創面內細菌繁殖，細菌通過分泌蛋白、壞死物質形成生物膜，削弱免疫細胞、抗生素等對細菌的作用，不能及時清除有害物質，延緩創面愈合[34]。組織再生需要流動的血液提供氧氣和營養并為中性粒細胞、巨噬細胞滲出活化清除壞死物質提供條件，充足的血液可以改善局部微循環，減少感染發生。MSCs-Exo可分泌VEGF、堿性成纖維細胞生長因子(BFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)等多種生長因子，促進血管生成[35]。MSCs-Exo還可通過上調miR-31、hsa-miR-760 基因的表達和下調hsa-miR-423-3p 基因的表達，影響ITGA5 和 HDAC5 基因的表達，達到促血管化的目的[36-37]。成纖維細胞可通過遷移、增殖和分泌等來促進創面內組織生長、填滿創面[38]。MSCs-Exo激活 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路促進成纖維細胞增殖、遷移，增加Ⅰ型和Ⅲ型膠原分泌，使Ⅱ型膠原沉積增加，促進成纖維細胞分泌ECM相關蛋白和MMP-1分泌，增加TGF-β1 和纖連蛋白表達，加快創面愈合速度，促進上皮化的發生[39-40]。

3.2.5MSCs-Exo創面修復臨床前研究及臨床應用

MSCs-Exo可有效抑制異常創面炎癥反應，促進創面愈合，目前市面上存在多種包含外泌體的醫學產品。如直接將間充質干細胞外泌體提純后制成水凝膠，緩慢釋放可用于創面修復及瘢痕治療[41]；將人臍帶MSCs-Exo、表皮生長因子和透明質酸鈉配合，可用于創面修復及美容去瘢[42]；添加纖連蛋白、VEGF、纖維芽細胞生長因子、上皮細胞生長因子、HGF、TGF、1-磷酸鞘氨醇、神經酰胺-1-磷酸，制成包含外泌體的復合物，同樣具有不錯的創面修復效果[43]；將外泌體制成凍干粉，可更加長久地發揮其生物活性；同時，將外泌體加入粘貼材料，制成敷貼，貼附于壓瘡皮膚，可降低創面組織中肌成膠原纖維細胞數量，并調節Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白及高遷移率族蛋白1(HMGB1)、TGF-β表達水平，動態調控創面愈合過程[44]；將芭花、洋甘菊、金縷梅、海藻酸鹽等成分與MSCs-Exo制作成為復合物，可加速創面止血過程，促進損傷修復，同時具有抗炎抑菌、止癢、保濕等效果，加速創面愈合[45]。

4 小 結

皮膚損傷是臨床常見疾病之一，我國整體創面發生率呈上升趨勢，糖尿病、血液循環障礙等原因導致的慢性創面逐漸增多。炎癥反應期延長引起組織血液灌注不足及缺血性損傷，可能是創面難愈的重要原因。創面異常炎癥反應是臨床上慢性難愈合創面治療的主要靶點之一， MSCs-Exo可有效促進巨噬細胞向M2型轉化，減少中性粒細胞的浸潤和激活，抑制樹突狀細胞活化并誘導耐受，減少皮損中肥大細胞數量，抑制自身反應性淋巴細胞增殖，加速活化T淋巴細胞的凋亡，上調抑制自身反應性淋巴細胞比例，誘導免疫耐受，促進成纖維細胞增殖、遷移，調節膠原沉積類型，促進血管生成，增加IL-10、TGF-β等抗炎因子的分泌，減少TNF-α、IL-1α等炎癥因子的分泌多途徑發揮抗炎作用，縮短創面炎癥反應時間，加速創面愈合，并預防瘢痕形成。MSCs-Exo作為創面修復和再生醫學的研究熱點，既可保留MSCs的功能特性，同時具有更低的免疫原性與更高的安全性，有望成為一種極具前景的創面修復治療方式，且臨床上目前已存在針對創面修復的多種包含外泌體的醫療產品。明確MSCs-Exo臨床應用安全性、劑量、療程與創面炎癥嚴重程度及持續時間的關系，明確其在人體內的藥代動力學、不良反應發生及如何批量獲取與儲存MSCs-Exo均為MSCs-Exo臨床應用需要首先解決的問題，需要開展更多多中心及大樣本的隨機對照試驗和臨床研究來明確。