GSK-3β在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌中的作用

張丹眉 石春霞 龔作炯

肝癌是世界第六大腫瘤，同時(shí)在癌癥死亡率中排名第四。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是肝癌中最常見(jiàn)的類型，占所有肝癌病例的75%～85%[1]。病毒感染、酗酒以及含有黃曲霉食物的攝入等各種因素都會(huì)引起肝細(xì)胞癌的發(fā)生，其中最主要的因素是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus HBV)感染。盡管HBV疫苗在全球廣泛接種，但乙型肝炎的發(fā)生率仍居高位[2]。肝細(xì)胞癌的治療方式多樣，但復(fù)發(fā)率、耐藥性以及治療效果并不佳。主要作用于某種重要的信號(hào)通路中某種或多個(gè)分子的治療方法，如靶向PD-1、PD-L1的免疫治療，在大多數(shù)疾病中都有著良好的治療前景。因此，了解肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的信號(hào)通路，對(duì)開發(fā)新的治療方法、提高現(xiàn)有治療方法的療效都有著重要的意義。

糖原合成酶激酶-3(glycogen kinase synthase-3, GSK-3)是一種在哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞中廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有多種功能。GSK-3首次報(bào)道是磷酸化糖原合酶，參與糖原合成過(guò)程；隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種GSK-3的底物，磷酸化其絲氨酸和蘇氨酸殘基[3]。除此之外，GSK-3還參與多條信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、死亡以及蛋白質(zhì)合成等多種生理過(guò)程[4]。正因?yàn)槠涠鄻拥纳砉δ芙豢椨诩?xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，GSK-3有望成為包括肝臟疾病在內(nèi)的許多疾病的重要靶向分子。

一、GSK-3結(jié)構(gòu)和功能

GSK-3一般有兩種亞型，即α亞型和β亞型，分別由兩種不同基因編碼。這兩個(gè)蛋白的同源性達(dá)84%，激酶結(jié)構(gòu)域高達(dá)98%的同源性，而在N-端和C-端具有差異性[5]。盡管它們具有相似的結(jié)構(gòu)和一些交叉功能，但他們?cè)跈C(jī)體中仍發(fā)揮各自的作用且功能上并不冗余。有研究顯示，GSK-3α基因敲除小鼠可以存活，GSK-3β基因敲除小鼠則會(huì)在胚胎時(shí)期死亡，因此并沒(méi)有另一個(gè)同源物質(zhì)可以替代GSK-3β[6]。

GSK-3β在細(xì)胞中普遍表達(dá)，細(xì)胞靜息時(shí)便具有活性，在接受外界刺激后常成抑制狀態(tài)。磷酸化GSK-3β絲/蘇氨酸殘基調(diào)節(jié)其活性。據(jù)研究，包括生長(zhǎng)因子、激素以及其他細(xì)胞外的刺激等分子通過(guò)磷酸化GSK-3β的9位絲氨酸(Ser9)而抑制其活性，最常見(jiàn)的便是蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)。GSK-3β被磷酸化的絲氨酸由絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶-1(protein phosphatase 1,PP1)和PP2A等去磷酸化后被激活；同樣被p38 MAPK磷酸化390位(Thr390)蘇氨酸后也會(huì)抑制其活性。相反，若是磷酸化GSK-3β 216位蘇氨酸(Ser216)后則會(huì)激活它的功能[7-9]。

GSK-3β包含底物磷酸化位點(diǎn)以及底物結(jié)合位點(diǎn)，擁有超過(guò)100種底物，其中包括結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、信使分子、離子轉(zhuǎn)運(yùn)體、細(xì)胞周期蛋白和控制凋亡反應(yīng)的蛋白等[7]。此外，GSK-3β身處信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，其中最重要的是胰島素通路和Wnt通路，參與調(diào)節(jié)多種生理、病理過(guò)程，在糖原合成、細(xì)胞增殖、自噬、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。

二、HBV感染后作用于GSK-3β的上游通路

HBV的基因組獨(dú)特，由不完全的環(huán)狀雙鏈DNA組成，包括4個(gè)開放讀碼框，分別編碼表面抗原S抗原、核心抗原、具有反轉(zhuǎn)錄活性的DNA聚合酶和RNA酶以及X蛋白。X蛋白，也即HBx，長(zhǎng)度大約16 000，具有反式激活作用，可以激活HBV本身或者細(xì)胞的多種調(diào)控基因，促進(jìn)HBV或者其他病毒的復(fù)制[11]；HBx在HBV感染后進(jìn)展為肝細(xì)胞癌的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。人類、土拔鼠和沙鼠的肝病毒科成員都與肝癌有關(guān)，大多數(shù)肝癌中整合的HBV DNA含有全部或部分HBx基因[12]。

(一)PI3K/AKT 磷酸酰肌醇3-激酶(phosphatidyli-nositol-3-kinase,PI3K)/AKT通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)的基本信號(hào)通路，由生長(zhǎng)因子等刺激激活，可以抑制細(xì)胞凋亡。PI3K/AKT通路在多種癌癥中被上調(diào)，許多病毒編碼可以激活該通路的蛋白質(zhì)。在HBV感染細(xì)胞中，表達(dá)的HBx蛋白可以刺激體外培養(yǎng)的人或大鼠原代肝細(xì)胞中的PI3K/AKT通路，并抑制HBV復(fù)制以及細(xì)胞凋亡[13]。HBx也可以通過(guò)激活PI3K/AKT通路而上調(diào)甲胎蛋白(alpha fetoprotein , AFP)表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌干細(xì)胞形成[14]。由此HBV感染后HCC形成過(guò)程中上調(diào)的PI3K/AKT通路通過(guò)某項(xiàng)機(jī)制發(fā)揮作用。GSK-3β作為AKT的下游靶標(biāo)之一，HBx磷酸化激活A(yù)KT后，上調(diào)Ser9磷酸化的GSK-3β，抑制其活性而上調(diào)β-catenin激活下游復(fù)雜通路。用AKT特異性抑制劑LY294002治療HBV感染，可以抑制磷酸化狀態(tài)的AKT水平增加，同時(shí)磷酸化的GSK-3β的水平同樣降低而導(dǎo)致β-catenin水平降低[15]。因此阻止GSK-3β磷酸化，刺激其活性可能成為阻止HBV相關(guān)HCC發(fā)生的一個(gè)有效治療方向，其中AKT有望成為重要的靶標(biāo)分子。

(二)SIRT2/AKT 哺乳動(dòng)物信號(hào)調(diào)節(jié)子(silent information regulator ,SIRT)是一類依賴NAD+的哺乳動(dòng)物組蛋白去乙酰化酶，調(diào)節(jié)衰老、凋亡、轉(zhuǎn)錄、炎癥以及氧化應(yīng)激[16]。在7個(gè)SIRT中，SIRT2蛋白尤其是1亞型(SIRT2.1)在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)并促進(jìn)HBV復(fù)制，在許多肝癌中過(guò)表達(dá)；高水平的SIRT2使化療藥物的作用效果大大降低[17]。有研究指出，HBx可以上調(diào)SIRT2的表達(dá)，而復(fù)制缺陷的HBV則會(huì)降低SIRT2活性，同樣SIRT2在HBV復(fù)制和誘導(dǎo)的肝癌中也起著積極作用，這一過(guò)程并不依賴HBx。不僅如此，SIRT2對(duì)AKT的去乙酰化是其完全激活的關(guān)鍵，激活的AKT可以磷酸化抑制GSK-3β，從而激活下游一系列反應(yīng)。因此HBx通過(guò)上調(diào)SIRT2/AKT而作用于GSK-3β，可以促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；高水平的SIRT2更是與更晚期的腫瘤分期和降低患者存活率相關(guān)[18]。

(三)ERK 與PI3K/AKT通路相類似，在正常生理中生長(zhǎng)因子等因素可以通過(guò)激活Raf/MEK/ERK通路而磷酸化GSK-3β(Ser9)，從而發(fā)揮其糖原合成效應(yīng)；在HBV感染細(xì)胞中，預(yù)先使用ERK抑制劑可以降低磷酸化GSK-3β水平，而抑制其下游效應(yīng)[19]。

綜上所述，HBx在HBV感染后HCC的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，穩(wěn)定表達(dá)的HBx一方面通過(guò)激活A(yù)KT或ERK而磷酸化Ser9 GSK-3β；另一方面，HBx與SIRT2相互作用，正反饋完全激活A(yù)KT而磷酸化GSK-3β。除此之外，HBx蛋白還可以通過(guò)激活SCr激酶，上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)激活的SCr激酶又可以直接使GSK-3β Thr43處殘基磷酸化，抑制其活性[12]。在復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，被抑制的GSK-3β恰好激活多種關(guān)鍵通路，刺激腫瘤發(fā)生以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

三、GSK-3β下游靶向分子

(一)Wnt/β-catenin Wnt信號(hào)通路由細(xì)胞表面受體和胞內(nèi)傳遞信號(hào)的蛋白質(zhì)組成，主要調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。廣義上講，Wnt通路分為經(jīng)典和非經(jīng)典通路，而Wnt/β-catenin是一條經(jīng)典的Wnt通路。在沒(méi)有信號(hào)刺激時(shí)，通路處于未激活狀態(tài)，GSK-3β與結(jié)腸癌相關(guān)基因蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)以及Axin結(jié)合形成蛋白質(zhì)復(fù)合物與β-catenin結(jié)合，其中GSK-3β行使催化功能，磷酸化β-catenin的N端絲氨酸和蘇氨酸，使其被識(shí)別并泛素化，最終被蛋白酶體水解。而在Wnt信號(hào)分子與胞膜上的FZD受體蛋白結(jié)合后，激活胞質(zhì)內(nèi)Dsh蛋白，使得GSK-3β磷酸化，解離GSK-3β/APC/Axin復(fù)合體，而致β-catenin聚集并核異位，與核內(nèi)TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合，促進(jìn)腫瘤相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，如c-myc、cyclin D1等[20, 21]。在此通路中，GSK-3β的活性關(guān)系到關(guān)鍵活性分子β-catenin不被降解而正常發(fā)揮其致癌功能。

β-catenin主要定位在細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核中，在血清中也可以檢測(cè)到。有研究表明，在慢性乙型肝炎以及HBV相關(guān)肝硬化患者血清中檢測(cè)到β-catenin水平升高，而HBV相關(guān)HCC中并未有類似結(jié)果，這可能與HCC細(xì)胞較少出現(xiàn)自噬、壞死而活躍增殖以及β-catenin不斷聚集以及核異位有關(guān)；同時(shí)表明血清中升高的β-catenin與HBV相關(guān)肝疾病進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，為此β-catenin被認(rèn)為可以作為診斷HBV相關(guān)疾病發(fā)展階段的重要標(biāo)志[15]。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)表明，Wnt/β-catenin通路與許多疾病相關(guān)，尤其是腫瘤形成和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，同時(shí)也被認(rèn)為是HBV誘發(fā)HCC的主要原因。有研究顯示，多數(shù)HBV感染后發(fā)生HCC患者的HBx發(fā)生突變，轉(zhuǎn)染突變的HBx可以觀察到磷酸化GSK-3β水平升高，Wnt/β-catenin被激活，肝癌細(xì)胞的增殖和遷移情況活躍[22]。

有研究指出，通過(guò)胰島素和Wnt兩種途徑的信號(hào)似乎調(diào)節(jié)不同的GSK-3β池。例如胰島素激活下游AKT，而AKT磷酸化GSK-3β并不能影響β-catenin的聚集和移位，這也保證了正常細(xì)胞的生理狀態(tài)。但用AKT特異性抑制劑LY294002治療HBV感染，可以觀察到磷酸化GSK-3β以及β-catenin水平降低，這可能歸因于HBx介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)的反式激活效應(yīng)，同時(shí)也與不同細(xì)胞類型有關(guān)[23]。胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1 IRS1)基因的啟動(dòng)序列含有β-catenin的結(jié)合位點(diǎn)，HBx可以通過(guò)wnt/β-catenin通路激活而上調(diào)igr1表達(dá)，HBx也可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Sp1磷酸化上調(diào)IGF2和IGF1R的表達(dá)，激活I(lǐng)N/IGF通路，隨后激活的PI3K/AKT和MAPK/ERK又可以激活Wnt/β-catenin而形成一個(gè)正反饋環(huán)，不斷刺激感染細(xì)胞腫瘤發(fā)生和進(jìn)展[12]。在此過(guò)程中，GSK-3β將其連接成信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，在促進(jìn)β-catenin聚集以及核異位的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)正反饋激活I(lǐng)N/IGF通路發(fā)揮抗凋亡功能。

(二)AR/ CCRK 據(jù)統(tǒng)計(jì)，HBV相關(guān)性肝癌流行病學(xué)特征有其突出的男性優(yōu)勢(shì)，即男女比例為5～7：1。在男性HBV攜帶者中，血清雄激素水平和雄激素受體(androgen receptor AR)激活水平與肝癌風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[24]。在動(dòng)物模型中，小鼠肝臟特異性敲除AR基因顯著降低了HCC的發(fā)病率，進(jìn)一步證實(shí)了AR在HBV誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中促進(jìn)了肝癌的發(fā)生[25]。已有研究證實(shí)，HBx通過(guò)激酶途徑促進(jìn)AR二聚化和磷酸化，而提高AR的轉(zhuǎn)錄活性。AR的二聚化是通過(guò)AR的N-末端和C-末端的相互作用發(fā)生的。研究觀察到GSK-3β調(diào)節(jié)AR N-C相互作用[7, 26]，HBx通過(guò)種種途徑磷酸化Ser9位殘基抑制GSK-3β活性，從而促進(jìn)AR二聚化。隨后，激活的AR與靶基因中的雄激素反應(yīng)原件(androgen response elements，AREs)結(jié)合促進(jìn)肝癌的發(fā)生。除此之外，激活的AR還識(shí)別HBV基因組增強(qiáng)子中保守的ARE，從而增加包括HBx在內(nèi)的HBV基因的轉(zhuǎn)錄。因此，AR和HBx在HBV感染的肝細(xì)胞中形成了病毒-宿主正反饋環(huán)[25]，正是這種正反饋環(huán)加強(qiáng)了AR的激活以及HBV活躍表達(dá)。蟾蜍靈(Bufalin)是從中華大蟾蜍皮膚腺中提取的主要活性成分，被認(rèn)為是通過(guò)阻斷HBx/AR信號(hào)軸而抑制HBV相關(guān)HCC的細(xì)胞增生，同時(shí)有數(shù)據(jù)表明，蟾蜍靈在HBV相關(guān)HCC的治療效果優(yōu)于非HBV相關(guān)的HCC。由此說(shuō)明HBx/GSK-3β/AR軸在HBV感染后HCC發(fā)生發(fā)展中的重要地位。

不僅如此，細(xì)胞周期相關(guān)激酶(cell cycle-related kinase，CCRK)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族，是細(xì)胞增殖中不可或缺的激酶。有研究表明，CCRK是AR靶向的激酶，激活的AR上調(diào)CCRK的表達(dá)，高表達(dá)的CCRK通過(guò)磷酸化Ser9 GSK-3β抑制其活性而穩(wěn)定以及募集β-catenin,通過(guò)β-catenin/TCF通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生以及癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而磷酸化的GSK-3β又可以促進(jìn)AR激活，形成作用環(huán)[27]。轉(zhuǎn)染RNA沉默CCRK的基因，抑制了CCRK/GSK-3β/β-catenin/AR調(diào)控環(huán)，顯著抑制了HBx誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。

總而言之，HBV感染后通過(guò)HBx/GSK-3β/AR/CCRK軸一方面形成病毒-宿主正反饋環(huán)促進(jìn)腫瘤發(fā)生；另一方面激活的AR通過(guò)CCRK/GSK-3β/β-catenin通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移。

(三)Cyclin D1 細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是細(xì)胞周期進(jìn)程以及細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子，是癌癥中最常改變的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之一。在正常有絲分裂細(xì)胞中，接受有絲分裂調(diào)節(jié)信號(hào)后，新合成的cyclin D1與胞質(zhì)中周期蛋白依賴性激酶CDK4或CDK6結(jié)合組裝形成的復(fù)合體蛋白，在細(xì)胞周期的G1中期轉(zhuǎn)運(yùn)并積聚于細(xì)胞核內(nèi)，磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb)及相關(guān)分子，從而激活轉(zhuǎn)錄進(jìn)入S期所必須的E2F轉(zhuǎn)錄因子，最終進(jìn)入正常的細(xì)胞周期。與β-catenin類似，具有活性的GSK-3β磷酸化cyclin D1的Thr286位殘基，促進(jìn)cyclin D1蛋白被蛋白酶體降解[28]。這種cyclin D1及時(shí)表達(dá)以及降解的平衡對(duì)于維持正常的細(xì)胞周期是至關(guān)重要的，在多種癌癥中對(duì)于cyclin D1正常水平的干擾，是引起癌細(xì)胞活躍增殖的關(guān)鍵。

HBV感染細(xì)胞中高表達(dá)的cyclin D1參與了HCC的發(fā)生發(fā)展。然而在一些實(shí)驗(yàn)性的轉(zhuǎn)基因小鼠的致癌模型中，僅cyclin D1的過(guò)表達(dá)并不足以誘發(fā)腫瘤[19]，提示雖說(shuō)HBx可以在轉(zhuǎn)錄水平上激活cyclin D1，但仍有其他過(guò)程參與HCC發(fā)生。隨后，在轉(zhuǎn)染HBx細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的HBx可以在肝癌細(xì)胞中異位表達(dá)，將cyclin D1蛋白的半衰期從40～60 min延長(zhǎng)至80～110 min，同時(shí)檢測(cè)到高水平Ser9磷酸化的GSK-3β以及Thr286磷酸化cyclin D1下降。此外共轉(zhuǎn)染不同劑量的GSK-3β-S9A突變體以及HBV和cyclin D1后，可劑量依賴性抑制外源性cyclin D1表達(dá)，說(shuō)明活性的GSK-3β可以逆轉(zhuǎn)HBx對(duì)cyclin D1的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定[19]。GSK-3β在穩(wěn)定cyclin D1水平過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。此外失活的GSK-3β同樣可以穩(wěn)定β-catenin水平，并促發(fā)cyclin D1基因轉(zhuǎn)錄，這也能很好地解釋活性的GSK-3β可以逆轉(zhuǎn)HBx對(duì)cyclin D1的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。

AKT、ERK等可以作為上游信號(hào)分子磷酸化Ser9 GSK-3β，使用ERK抑制劑U0126預(yù)處理細(xì)胞可顯著降低HBx介導(dǎo)的cyclin D1增加，同時(shí)伴有磷酸化Ser9 GSK-3β的減少，但PI3K/AKT抑制劑LY294002不能達(dá)到這種效果。因此認(rèn)為特異性ERK磷酸化的GSK-3β可以在HBx誘導(dǎo)cyclin D1轉(zhuǎn)錄以及穩(wěn)定聚集的過(guò)程中發(fā)揮作用。

除了上述的三種重要的下游靶向分子，HBx通過(guò)不同通路磷酸化的GSK-3β還可以作用于其他分子，如穩(wěn)定Snail蛋白而誘導(dǎo)HBV相關(guān)HCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖遷移[29]；GSK-3β同樣參與調(diào)節(jié)notch的穩(wěn)定性，失活的GSK-3β失去其抑制notch的水解酶的能力，而促進(jìn)功能性結(jié)構(gòu)域的剪切和轉(zhuǎn)運(yùn)也即NICD的形成和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[30，31]。

四、小結(jié)

上述的眾多細(xì)胞通路，顯示了HBx/GSK-3β在HBV感染后HCC發(fā)生過(guò)程中的重要地位，同時(shí)表明激活GSK-3β可以作為延緩HBV相關(guān)疾病病程、阻止HBV相關(guān)HCC發(fā)生的一個(gè)重要的治療方向，主要可以通過(guò)兩種方式激活GSK-3β：①抑制GSK-3β上游因子如AKT、ERK、SIRT2等；②直接使用GSK-3β激活劑。雖然越來(lái)越多的研究顯示GSK-3β在HBV相關(guān)HCC發(fā)生中占據(jù)了重要地位，但有關(guān)GSK-3β的相關(guān)藥物還未經(jīng)過(guò)充分的實(shí)驗(yàn)得到應(yīng)用，GSK-3β在HBV感染者體內(nèi)的各通路之間的相互作用、相關(guān)治療方式的研究仍需深入探討。