α-1抗胰蛋白酶缺乏癥相關肝病的診治研究進展

楊子新 王勝蘭

AAT是一種蛋白酶抑制劑，主要在肝細胞中表達，然后通過內質網分泌到血液中，以保護肺免受中性粒細胞蛋白水解酶的降解，由位于14號染色體長臂上的 SERPINA1基因編碼，Pi*M是正常的等位基因，但據報道，該位點上已經發生了超過150個突變，最常見的是Pi*Z型和Pi*S型[1]。Z型突變是342位谷氨酸被賴氨酸取代，S型突變是264位的谷氨酸被纈氨酸取代，還有一些罕見病變，如Mmalton型等。Z型產生的AAT是正常水平的10%～20%，S型產生的AAT是正常水平的60%～80%[2]。ZZ純合子是臨床上導致AATD最常見的基因型，約96%的相關疾病與此相關，血清AAT水平極低，僅達正常的10%～15%，另外少部分是SS、SZ、MZ等，血清AAT水平僅為正常值的35%～70%[3]。由于SERPINA1基因突變導致肝細胞內生成的AAT異常聚集，異常聚集的AAT多聚體(Z-ATT)不能通過內質網分泌到循環血液中，滯留在肝細胞內，造成蛋白毒性肝損傷，引起成人及兒童肝病。

一、遺傳流行病學特性

典型的重癥AATD多由Pi*Z純合子變異引起，在歐洲人中的比例大約是1：2000，其特點是血清AAT濃度顯著降低(低85%左右)，蛋白酶與蛋白酶抑制劑之間嚴重失衡；雜合型Pi*MZ可在1/30高加索人中發現，AAT血清濃度基本正?；蛘咻p微降低；復合雜合型Pi*SZ是由反式Pi*Z和Pi*S變異體同時存在所致，它在高加索人中占到的比例大約為1/500，表現出中等的AAT血清濃度；Pi*SS基因型(即純合子Pi*S等位基因)與Pi*SZ大致相同，但似乎不構成發生肝病的臨床相關危險因素[4]。

二、AATD相關肝病的發病機制

嚴重的AATD病例多由Pi*Z純合子引起，Z-AAT蛋白在內質網積聚引起相關肝病，但是其發病機制目前尚不完全清楚。

(一)Z-AAT引起內質網應激導致肝細胞損傷 Z-AAT通過改變各種細胞器的關鍵功能在AATD相關肝病的發病機制中發揮關鍵作用，如內質網、溶酶體、蛋白酶體降解系統和線粒體等[5]。線粒體，細胞內的雙膜結構，是發生呼吸和能量產生的高度動態的細胞器。由于肝臟在碳水化合物、脂肪和蛋白質代謝動態平衡中的中心作用，肝細胞含有高密度的線粒體。Z-AAT引起內質網應激，然而內質網應激又與脂滴的形成有關。在許多蛋白質錯誤折疊疾病中，脂滴的積累被觀察到是內質網應激的普遍下游效應[6]。脂滴是一種細胞器，作為動物細胞中脂類的儲存室，也與線粒體相關。值得注意的是，脂滴已被證明通過確保最大限度的氧化代謝和動態平衡來調節線粒體的動態。線粒體在脂滴表面蛋白Perilipin 5 (Plin5) 的介導下重新聚集到脂滴表面，改變線粒體的生物性能[7]。脂滴作為與內質網相關的細胞器，通過重新平衡內質網脂類平衡，去除錯誤折疊的蛋白質，調節自噬，對內質網穩態的破壞做出反應，起到保護內質網應激的作用，因此內質網應激增強了脂滴的形成和積累，脂滴產生適應性反應大量招募其周圍的線粒體，負責為需要ATP的脂質合成和循環過程提供ATP，線粒體耗氧量和ATP產生增加，導致線粒體氧化和還原壓力增大，從而導致肝細胞損傷甚至死亡[8]。

(二)Z-AAT使肝臟中的線粒體發生自噬 既往在Pi*Z小鼠模型的肝臟中自噬被結構性地激活[9]。自噬是一種細胞內蛋白分解途徑，在應激、發育和營養缺乏的時候，特殊的空泡從內質網膜上產生并吞噬降解的靶標，可能構成一種通過降解突變體Z-AAT來保護肝細胞的機制[10]。肝細胞內自噬活性的顯著增加可能會導致自噬小體中的各種亞細胞結降解。早期自噬液泡中線粒體的超微結構特征表現為在同一細胞的其他區域和在其他細胞中，線粒體完全被包裹在周邊的內質網膜內，有時具有完整的、正常的脊和正常的電子密度；有時線粒體隨著電子密度的增加而被壓縮，被兩個或多個光滑的膜包圍。晚期自噬液泡的特征表現為一些線粒體位于多層膜內，整個液泡經?；蛘邔嶋H上與溶酶體融合，線粒體幾乎完全轉化為電子致密碎片[11]。LAMP1蛋白也是已知的標記晚期自噬小體。Jeffrey等[9]用溶酶體膜蛋白LAMP1的抗體免疫標記檢測了Pi*Z肝臟樣本。含有許多線粒體和豐富的內質網，有容易識別的空泡，其中包含線粒體結構，可辨認出脊狀突起，空泡被LAMP1標記為陽性。在正常肝標本中，線粒體周圍的LAMP1陽性結構很難被發現。綜上所述表明，線粒體自噬在Pi*Z肝臟中是一個頻繁和持續的過程[11]。

(三)Z-AAT激活JNK途徑上調SERPINA1的轉錄，加劇Z-AAT的積聚 c-Jun是JNK通過磷酸化激活的主要細胞底物之一，通過Pi*Z小鼠肝臟中磷酸化c-Jun水平的增加,證實了c-JUN的激活[12]。c-Jun通過結合和反式激活SERPINA1的AP-1位點，上調SERPINA1的表達。與對照組相比，Pi*ZZ患者的肝臟表現出更強的JNK活性，表明Z-AAT激活JNK途徑上調SERPINA1的轉錄，加劇Z-AAT的積聚，損害肝細胞[13]。

(四)Z-AAT及乙型肝炎表面抗原雙重蛋白毒性應激 HBV S基因(HBs)產生三種表面(包膜)蛋白，即小表面蛋白(S)、中間表面蛋白(前S2和S)和大表面蛋白(前S1、前S2和S)。由乙型肝炎表面基因突變引起的大表面蛋白的過度形成限制在內質網中的膜狀顆粒的形成，導致其在內質網中積累，形成毛玻璃樣肝細胞。盡管Z-AAT和HBs表現出不同的溶解性質和不同的分布模式，但HBs-PIZ動物均表現出Z-AAT/HBs在降解途徑中的保留和自噬適配器p62的顯著積累[14]。同時對含有p62的顆粒的分離顯示保留了HBs/Z-AAT。P62的積聚又導致p62-Nrf2軸的激活和活性氧物種的出現。所以當兩種主要的蛋白毒性應激同時存在時，通過蛋白滯留和p62-Nrf2軸的激活促進了肝損傷的發展[15]。

(五) NSAIDs藥物的作用 AATD的動物模型研究表明，NSAIDs藥物可導致Pi*Z小鼠肝臟損傷加重，表現為肝細胞增殖增加和caspase 9活性增強[16]。NSAIDs藥物又可激活Pi*Z小鼠體內IL-6-STAT3細胞因子信號通路。前列腺素可負向調節TNF-IL-6-STAT3信號通路，而NSAIDs抑制前列腺素合成，故可增強該信號通路，由于該信號通路可誘導肝臟中包括AAT在內的急性期時相反應物的表達，增加AAT的合成，從而增加錯誤折疊的蛋白質積累，進一步加重肝損傷[16-17]。

三、AATD肝病的臨床表現

(一)AATD中的成人肝病 AATD在成人中的發病年齡主要在50歲左右，帶Z和M(malton)等位基因的成人可能出現慢性肝炎、肝硬化或肝細胞癌，攜帶Pi*ZZ基因的成人中約40%存在有組織學意義的肝損傷和肝硬化[18]。目前認為，男性、年齡>50歲，代謝綜合征和肥胖是重度AATD成人患者進展為晚期肝臟疾病的危險因素。ATTD和飲酒的相關性尚不清楚，但酒精濫用似乎會加速AATD相關肝纖維化的進展[16]。

(二)AATD中的兒童肝病 AATD會導致兒童肝臟損傷，最常見的表現是新生兒肝炎綜合征，包括膽汁淤積性黃疸、喂養困難、肝脾大、生長困難、胃腸道出血等。然而多項研究表明，大多數Pi*ZZ兒童是健康的，在兒童時期并沒有被診斷出來；少數Pi*ZZ兒童發展為膽汁淤積性肝炎(新生兒肝炎綜合征)，主要表現為血清結合膽紅素、丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶升高；大多數患有膽汁淤積性肝炎的新生兒可自發改善,但是仍有一部分Pi*ZZ新生兒表現出嚴重肝病并發癥，如肝硬化、門靜脈高壓和肝功能衰竭[17]。

四、AATD的診斷

迄今為止，臨床醫生對AATD的認識遠遠不夠，診斷可能延遲5～10年。研究表明，80%～90%的AATD患者由于缺乏臨床癥狀，或被誤診為酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝病等其他肝硬化病因[19]。對于有肝臟疾病家族史、不明原因慢性肝病病史或臨床表現等患者應該行AATD檢測。

(一)血清AAT水平的測定 血清AAT水平可通過比濁法測定，有時也可使用乳膠增強免疫比濁法；目前已不再推薦使用放射免疫擴散法和火箭免疫電泳法。人群研究表明，血清AAT的最低閾值為11μmol/L(約57 mg/dL)，低于該值則AAT含量不足。但AAT是急性期反應物，發生炎癥時，真實的血清AAT水平可能會被高估，因此應該避免在患者炎癥期間測定血清AAT水平[20]。

(二)等電聚焦技術 對定量檢測AAT水平異常的患者，可進行表型檢測,根據各種突變，根據各種突變蛋白的等電點不同,用等電聚焦法檢測。根據各種突變蛋白在pH梯度下的電泳遷移率不同，將它們分成不同的類型:F、S、M、Z[21]。此外，當患者體內AAT含量比較低以及無效突變血中沒有AAT時，其表型可能不能被測定出來 尚需進一步借助基因測序。

(三)基因測序 AAT的基因分型通常從全血或干血斑中提取出DNA，采用PCR進行基因擴增，然后對反應產物進行自動測序。等位基因特異性基因分型試驗用于檢測更普遍的Pi*S和Pi*Z，以及罕見的變異Pi*Malton。當等位基因特異性基因分型分析不能提供AAT等位基因的完整鑒定時，需對SERPINA1編碼區進行直接測序[22]。

(四)肝活檢 肝活檢是評估肝臟損傷和纖維化程度非常有用的工具。對于AATD相關肝病患者，肝活檢可能不是必需的檢查手段，但仍是明確診斷的金標準。

五、AATD相關肝病的治療

目前尚無針對AATD相關肝病的治療藥物，肝移植是解決晚期肝硬化的唯一途徑。隨著對AATD肝病的認識不斷加深，多種針對性的治療方案成為研究的熱點。

(一)一般治療 目前針對AATD引起的肝病無特異性方法，進行性肝損傷的治療主要以支持為主，包括注意營養，預防軟骨病，以及凝血障礙的早期識別和治療。臨床醫生應治療門靜脈高壓并處理并發癥，如門脈高壓性胃病、食管胃底靜脈曲張出血和腹水等。

(二)肝移植 對于終末期肝病患者，肝移植是唯一有效的治療手段。在成人患者中，肝臟病變通常發展到明顯的肝硬化或者肝細胞癌時才被發現，肝移植可以獲得較好的治療效果；在兒童患者中，一部分出現長期黃疸，但是未見進一步的并發癥，一部分出現明顯肝硬化需要進行肝移植治療。AATD肝病患者肝臟可能很快發生失代償，因此應該早期對AATD高?；颊咝懈喂δ艿娜嬖u估，已期盡早干預，獲得較好的治療效果[23]。

(三)未來治療新方向 針對AATD的現行治療方法多為靜脈注射純化人血漿來源的AAT，但肝臟疾病是由錯誤折疊的Z-AAT在胞內異常堆積所致，因此AATD相關肝病無明顯療效，只有抑制缺陷型Z-AAT的表達才能緩解或治療AATD相關肝病。其他的新方案包括：

1.小干擾RNA：小干擾RNA(siRNA)是一個長20～25個核苷酸的雙股RNA，主要參與RNA干擾現象。siRNA與N-乙酰半乳糖胺殘基偶聯，通過去唾液酸糖蛋白受體介導肝細胞特異性攝取[4]。siRNA片段加載到RNA誘導的沉默復合體中，靶向mRNA被細胞內的核酸酶降解，引發靶向mRNA降解，抑制突變蛋白的產生，使血清和肝臟Z-AAT水平顯著降低，從而減輕蛋白肝毒性[24]。

2.化學伴侶：化學伴侶是一類協助新生肽鏈正確折疊的蛋白質，可以穩定天然AAT，并改善蛋白質的錯誤折疊，如4-苯基丁酸及氧化三甲胺等。但既往人體試驗表明，人體安全水平的化學伴侶達不到小鼠模型中的藥物濃度，肝細胞內質網中的化學伴侶藥物濃度不足，因此無法有效地發揮作用[25]。

3.自噬增強劑：其可誘導自噬，促進異常蛋白質的降解。Z-AAT可以激活NF-κB信號通路，參與自噬，增強劑如卡馬西平、西羅莫司、膽汁酸和熊去氧膽酸能加強該通路，但這些藥物尚處于臨床試驗階段[26]。

4.合成肽：其具有防止Z-AAT在肝細胞內積聚的潛力。與AAT反應環P7-2序列相對應的6肽被證明完全抑制Z-AAT的聚合，而對正常形式的AAT沒有任何抑制作用[27]。 因此，該分子具有防止Z-AAT在肝細胞內積聚的潛力，從而治療AAT相關肝病。

5.單克隆抗體：可以防止Z-AAT在細胞內聚合，增加肝臟分泌正常的AAT。目前已經開發了單抗檢測AAT的突變構象，如體內的scFv4B12是4B12單抗的單鏈可變片段，可以防止Pi*ZZ小鼠細胞內異常AAT的聚合，并增加其肝臟分泌，同時保留中性粒細胞彈性蛋白酶抑制功能，但是這種結果僅在體外證實過[28]。

6.基因修復技術：基因修復技術如CRISPR-Cas9正在改變許多醫學研究領域，如人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒感染，以及單基因疾病等[25]。Bjursell等[29]證實，Pi*ZZ小鼠通過CRISPR成功地進行基因編輯后，可以減少突變的Z蛋白聚集以及增加正常AAT的適度表達。

綜上，對于沒有任何明確病因的慢性肝病患者，應進AATD檢測。目前還沒有針對AATD相關肝病的特異性藥物治療方案，因此迫切需要探索和研發有效的藥物，以減少肝移植的需要和減緩疾病的進展?；蛑委熀蛃iRNA等新技術為治療AATD所致肝病帶來了希望，但目前多處于探索階段，仍需要進一步的研究。