肝臟疾病的現代治療方法

賈昊宇 楊長青

肝臟是一個重要的代謝中樞，在代謝中起著重要的作用，尤其適于新療法的發展。在過去的10年中，開發出許多新的肝臟靶向性的治療方法[1]。這些療法提供DNA或RNA相關的遺傳物質，以恢復或沉默關鍵的基因的表達。治療范圍不僅限于原發于肝臟的疾病，還包括代謝疾病，如高脂血癥或病因源自肝臟的疾病，如血友病[2]、卟啉癥[3]或原發性高草酸血癥[4]。這些進展突出了以肝臟為靶點的分子方法治療一些單基因疾病的治療潛力，例如α-1抗胰蛋白酶缺乏癥和肝豆狀核變性(WD)，以期將獲得的經驗用于治療更常見的疾病，如慢性HBV感染和非酒精性脂肪性肝病。本文綜述總結了現有的肝臟靶向分子治療方法。

一、mRNA療法

mRNA療法是一種新興的治療方法，該法一直是用于研究COVID-19疫苗的最前沿的方法[5]。mRNA疫苗與以減毒活病毒(如麻疹、腮腺炎和風疹)為基礎的疫苗使用相同的宿主機制：mRNA被傳遞到宿主細胞并轉化為病毒蛋白，被宿主免疫系統識別。目前批準的mRNA疫苗較為高效和安全[5]。雖然疫苗是mRNA類藥物的理想應用，因為少量瞬時表達的mRNA就足以產生大量的蛋白質表達并引發免疫記憶，但合成mRNA藥物的臨床前景不止于此。擴展到可通過重新表達缺陷蛋白來治療代謝相關疾病，以及使用抗體編碼的mRNA取代基于蛋白質的單克隆抗體來對癌癥進行個體化治療。

由于mRNA在體內的快速降解、宿主對外源RNA的反應[6]和mRNA傳遞的困難，最初使用合成mRNA作為藥物有很大的阻礙。核苷修飾是使合成mRNA能夠用于臨床治療的關鍵進展之一，可提高蛋白質翻譯和降低mRNA本身的免疫原性[7]。此外，脂質納米顆粒(LNP)技術也是保護mRNA免受降解和介導細胞內傳遞的理想方法[8]。

盡管尚未批準將mRNA用于人類肝病的治療，但目前已有臨床前研究證明其在動物肝臟疾病模型上取得成功[9]。在再生醫學領域，已發現mRNA介導的肝細胞生長因子和表皮生長因子的肝臟表達可誘導小鼠肝臟再生[10]。

二、基因添加

(一)不同類型的載體 在過去20年里，以肝臟為靶點的基因治療已成為治療單基因疾病的一個非常有潛力的選擇，大量的相關研究和一些臨床試驗正在進行中。治療目的是通過添加外源性DNA序列(基因添加)或修改患者基因組(基因編輯)來恢復目標基因的表達[1]。在許多可負載核酸到達肝臟的病毒和非病毒載體中，重組腺相關病毒載體(rAAV)是主要的候選載體[1]。rAAV具有較低的免疫原性和較低的整合能力，多數血清型具有較高的肝臟靶向性[11]。rAAV可在緩慢/未分裂細胞(如成年肝細胞)的細胞核中作用數年，在成人肝臟中表現出有利于基因轉移的特性，但在兒童肝臟中不能實現持久的轉基因表達，因為片斷不會復制，并且在肝臟生長過程中會被稀釋。且較難實施的是，在約40%的患者體內存在針對給定rAAV血清型的中和抗體(NAbs)，使這些患者排除在相應的臨床試驗之外[12]。此外，rAAV輸注后發生NAbs中和使再注射和連續使用成功率降低，迫使更換新的血清型。針對以上問題，開發出使用整合rAAV的策略，此方法可以產生永久的轉基因表達，甚至可能校正細胞的積極選擇，然而，它具有更高的基因毒性風險[1]。可以通過使用(i)整合載體(如優化的慢病毒[13])或(ii)依賴于核酸酶(如CRISPR)、轉座酶或無核酸酶的DNA模板(通過同源重組整合到內源性白蛋白位點)來實現[1,14]。在臨床前研究中，整合基因已成功通過rAAVs或LNP轉入肝臟[14]。雖然效果尚佳，但使用病毒載體有一定的風險，如下所述。

(二)免疫反應和肝毒性 盡管rAAV基因治療顯示出顯著的療效，但早期臨床試驗也突出了rAAV基因治療的局限性。首先是免疫反應，特別是T細胞對衣殼和NAb產生的反應[1,15]。T細胞介導的免疫反應通常發生在輸注后6～10周，表現為丙氨酸轉氨酶的增加，可能導致轉導后肝細胞的損傷，并與給藥載體劑量成比例[2]。早期類固醇治療可降低這種免疫反應，在隨訪中不會復發，因為它主要針對在初始階段短暫存在的衣殼抗原[2]。

第二個局限是其遺傳毒性。野生型(WT) AAV的Rep蛋白能夠將病毒DNA整合到宿主基因組中[15]，在不存在已知危險因素的肝細胞癌(HCC)患者中已鑒定出野生型AAV2基因組的插入，表明其致癌作用[16]。與野生型AAV相比，rAAV輸注后發生HCC的風險較低，因為包括Rep基因在內的所有編碼序列都被去除。盡管如此，在臨床前模型中發現，仍有發生隨機基因組整合的風險(0.1～1%)[17]。

除了遺傳毒性，臨床試驗中脊髓性肌肉萎縮或肌管性肌病(MTM)使用比血友病使用更高的載體劑量來實現肌肉靶向[>1014載體基因組(vg)/kg]，有報道提示該劑量可引起急性肝損傷[18]。需在糾正表型的適當載體劑量與潛在肝毒性和免疫反應的不良影響之間取得平衡，這些不良影響往往隨著載體劑量的增加而增加。

三、基因組和表觀基因組編輯

基因組或表觀基因組編輯療法是基因異常過表達或基因直接產生錯誤折疊蛋白質的疾病的理想應用。基因組編輯需要用核酸酶(如CRISPR-Cas9[1])對患者特定位點的基因組進行直接修改，或用核酸酶受損的Cas堿基編輯器[19]或引物編輯器[20]進行編輯。表觀基因組編輯使用與各種效應蛋白融合的Cas蛋白來介導基因組重組、染色質環化或組蛋白和DNA的生化修飾[21]。

首次成功在鐮狀細胞病中體外使用CRISPR法的臨床試驗證明，通過基因編輯細胞的自體移植可以糾正造血干細胞疾病；最近的一種體內方法通過LNPs將Cas9 mRNA和guide RNA傳遞到肝臟來治療TRR介導的淀粉樣變，導致循環的TTR水平下降了90%[22]。其有效性證明，這種方法將為已批準的重復siRNA注射提供一種有價值的替代方法。但其存在潛在的遺傳毒性、可能的脫靶效應以及可能導致大規模的染色體缺失[23]。此方法在人類患者的安全數據很少，毒性需要密切監測。

四、RNAi和ASO治療法

用短的互補RNA片段加工和翻譯mRNA是一個越來越常用的的治療選擇。使用這種機制的兩種主要模式是siRNAs和反義寡核苷酸(ASOs)[24]。在雞胚中首次證明了反義機制的有效性，合成的寡核苷酸阻斷Rous肉瘤病毒RNA的翻譯，從而抑制病毒復制[25]。ASOs由具有主鏈、糖和堿基特異性修飾的單鏈寡核苷酸(12～30個核苷酸)組成。它們的結構能夠與血漿和細胞表面蛋白進行高親和力的相互作用，從而在不需要其余配方或輔料的情況下促進其廣泛分布到不同組織[24]。ASOs結合互補(pre-) mRNA，并在空間上阻礙蛋白質翻譯。此外，ASOs的設計類似一個間隙，可容納一個未修飾的DNA核心，通過RNase H1招募誘導RNA裂解和降解。目前批準的ASOs主要針對治療杜氏肌營養不良、脊髓性肌肉萎縮等神經肌肉疾病，以及家族性乳糜小貧血綜合征(FCS)。但由于治療中仍有病例出現高甘油三酯血癥甚至并發胰腺炎，可能會限制其治療效用，因此，更應致力于提高ASOs的細胞靶向效應。在此基礎上，使用N -乙酰半乳糖胺(Gal- NAc)偶聯的ASOs，它可通過與唾液糖蛋白受體的高親和力相互作用將ASO定向到肝細胞，并使其效力增加20～30倍[26]。使用這種方法需要更少的ASO劑量。

與ASOs相比，雙鏈siRNA(19-22個堿基對)與細胞表面或血漿蛋白的相互作用不太明顯，因此需要一種更活躍的傳遞機制。siRNA通過RNA誘導沉默復合物 (RISC)使其目標mRNA失活：雙螺旋通過伴侶被載入到RISC中，在去除感覺鏈后，形成有活性的RISC。剩余的鏈作為與目標mRNA結合的向導，然后被RISC中的內切酶降解[25]。20年前報道了第一個成功的體外沉默[27]，但未修飾或僅簡單修飾的siRNA分子穩定性較差且治療效果不確定[25]。目前批準的基于siRNA的藥物主要依賴于RNAi與GalNAc的結合，其后通過受體介導的內吞作用被內化并釋放到細胞質中[28]。這些結合物的強組織特異性將不良事件的風險降到最低。此外，與靜脈注射相比，GalNAc偶聯物使用皮下注射后可獲得更高的肝siRNA暴露，因為肝細胞表面有限的唾液糖蛋白受體無法內化靜脈注射后過量的siRNA。

綜上，肝臟作為蛋白質和脂質代謝中心樞紐的重要作用使其成為治療肝臟相關疾病和全身疾病的靶點。使用rAAV載體的基因添加方法在血友病的III期臨床試驗中結果良好，目前正在對其在肝臟疾病中的療效進行評估。肝細胞一直是基因沉默研究的主要焦點，因為它們很容易被特異性靶向，并且在多種疾病相關途徑中發揮著關鍵作用。基因治療策略具有改變現代醫學的潛力，它們可以作用到小分子或治療性抗體難以到達的靶點，以期在更多領域發揮其精準靶向治療的作用。