植物種質資源保存研究進展

江笑丹 蔣真盛

(國家知識產權局專利局專利審查協作江蘇中心，江蘇 蘇州 215163)

親代傳給子代的遺傳物質叫作種質(germplasm)，具有種質并能繁殖的生物體叫作種質資源(germplasmresource)[1]。種質資源是物種進化、遺傳學研究及植物育種的物質基礎。

種質資源保存的方式有2種：原生境保存和非原生境保存，原生境保存是在原始生態條件下保存，可以保持高水平的遺傳完整性；非原生境保存是種質保存于該植物原生態生長地意外的地方，通過采集種子和植株部分在人工控制條件下保存種質。種質資源保存的方法包括種植保存(就地保存、遷地保存)、貯藏保存(又稱種子保存，包括短、中、長期庫)、離體保存(保存的材料種類多樣，有愈傷組織、懸浮細胞、幼芽生長點、花粉、花藥、體細胞、原生質體、幼胚、組織塊等)、基因文庫保存(通過重組DNA技術將植物DNA插入質粒，轉染到宿主細胞進行擴增)、利用保存(育成品種或育種中間材料)等[2，3]。

本文主要圍繞最常見、有效，操作簡便，又便于種質資源運輸和交流的種子保存和離體試管保存2種方法展開。旨在為今后種質資源的進一步研究和應用提供基礎。

1 種子的保存方式

1.1 種子低溫保存

種子被譽為農業的“芯片”，種業是保障糧食安全的源頭。種子的保存方式一般有常溫和低溫2種，低溫保存不同的溫度所對應的保存時間也不同，如，4℃的中期庫種子壽命一般為5～10a，-18℃的長期庫種子壽命可達到20a以上。然而，上述方法仍然無法做到永久保存，20a后需要對種子庫進行更新。為了進一步延長保存時間，人們考慮進一步降低保存溫度，采用液氮保存植物種子。申請人為長沙湘資生物科技有限公司的公開專利CN107691432A公開了一種白花蛇舌草種子的超低溫保存方法，首先用培養液培育，隨后轉入凍存管，加入抗凍液，采用梯度降溫以-1℃·min-1的速率降至指定溫度后投入液氮罐。所述培養液和抗凍液組分類似，均由MS培養液(最初為煙草細胞培養設計，含豐富的無機鹽、氨基酸和維生素)和DMSO、甘油等凍存保護劑組成。上述凍存程序和保存液組成適用于多種不同科屬的植物種子，如雞血藤(豆科)、桔梗(桔?？?、千金子(禾本科)、羌活(傘形科)、天南星(天南星科)、川貝母(百合科)、白及(蘭科)、馬比木(茶茱萸科)、光皮樹(山茱萸科)、黃精(百合科)、白蘞(葡萄科)、威靈仙(毛茛科)、七葉一枝花(百合科)、山蒼子(樟科)等。

近年來，科研人員致力于對保存液配方的調整，以期提高種子解凍后的發芽率。申請人為中禾生物種業集團有限公司的公開專利CN109892323A公開了一種玉米種子超低溫保存方法。該方法先采用PEG4000和甘油混合液對種子進行預處理，隨后置于羥丙甲纖維素(HPMC)和氯化鈉的混合溶液中進行凍存。HPMC分子量86000，屬于高聚物。采用含高聚物的保存液保存植物種質是本領域的常規手段。高聚物、低聚物和小分子化合物作為冷凍保護劑時起到的作用不同。小分子化合物易與水分子通過氫鍵結合，穿透細胞膜進入細胞內部，從而降低冰點。低聚物能夠誘導質壁分離，在細胞壁和細胞膜之間形成緩沖層，減輕冰晶生長對原生質體的機械壓力。高聚物雖然不能進入細胞內部，但是能夠結合水分子，降低細胞外自由水的含量，減少胞外冰晶的形成，從而起到冷凍保護的作用。結合上述凍存保護劑的保護機制，科研人員在確定保存液配方時，通常會將幾種不同類型的保護劑混合使用，從而起到多層次保護的目的。

對于種子低溫保存而言，保存液組分影響保存效果，如保存期限、種子萌發率等;降溫程序也與種子能否恢復活力息息相關。申請人為中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所的公開專利CN108684657A公開了一種降香種子超低溫保存方法。降香為常用的中藥品種，具有化瘀止血、理氣止痛的作用。基源為豆科植物降香檀樹干和根的干燥芯材。主要分布于海南白沙、東方、樂東、三亞等地，屬于頑拗性種子。降香因木材珍貴，成年植株幾乎被砍伐殆盡，近年來有些樹樁都被連根拔起，供作藥用或工藝美術用。因此，降香已是瀕危物種，亟需開發合理的資源保護方法。上述專利中采用如下梯度降溫的方法：先在室溫下用裝載液處理，取出后轉入玻璃化保護劑，分別以5～8℃、0～-2℃、-5～-8℃3個溫度節點進行降溫，最后投入液氮保存。凍存前種子的含水量為12.5%～13.5%。上述方法解決了現有技術中部分降香種子經超低溫保存后芽不能健康成苗的問題。

1.2 頑拗性種子

然而，并不是所有種子均適合超低溫保存。1973年，Roberts根據種子的貯藏行為，把種子分為正常性種子和頑拗性種子2類。頑拗性種子主要存在于2類植物中，水生草本植物，如菱、茭白等；具有大粒種子的多年生木本植物，如椰子、芒果、荔枝等熱帶植物以及板栗等溫熱帶植物。由于頑拗性種子的不耐脫水性，成熟脫落時代謝相對活躍，脫離母體后的生長狀態不斷變化，因此種子采收后要采用嚴格的保存機制來維持其活力。短期的貯存方法有吸漲貯藏或水浸貯藏、部分脫水室溫貯藏、氣調法等。對于小粒的頑拗性種子，通常能夠實現液氮下的超低溫貯藏，因為該類種子容易實現快速脫水的過程；而對于大粒的頑拗性種子，通常不適合在-196℃下保存，因為該類種子不易實現快速脫水，而緩慢脫水和降溫對種子是致命的[4]。申請人為肇慶學院的公開專利CN109362716A公開了一種柑橘砧木種子復合型保藏劑，所述柑橘砧木種子即為頑拗性種子。上述發明采用鉀鹽型高分子吸水樹脂與海藻酸鈉、殺菌劑相結合作為保藏劑，實現了柑橘砧木種子在3～5℃低溫條件下的全年儲藏，并保證了種子的高萌發率。上述發明中吸水樹脂能夠使得種子處在相對干燥的外環境中，結合殺菌劑的使用，使種子不易發霉變質。但是種子的含水量仍然處在較高的水平，若進行0℃以下的冷凍，仍然會因為冰晶損傷導致種子失活無法萌發。因此，申請人選擇在3～5℃的低溫環境下儲藏。上述保藏劑的選擇為頑拗性種子的低溫保存提供了一種新的思路。此外，海藻酸鈉的選擇是申請人從人工種子的制備方法中獲得的啟示。1978年英國科學家Murashige首次提出人工種子的概念，人工種子生產不受季節限制，易保存和運輸，可保持優良性狀，拯救珍稀和藥用物種，因此一直是研究熱點。在人工種子的生產過程中，羧甲基纖維素等凝膠劑以及殼聚糖等抑菌劑被用作人工種皮。人工種子的貯藏方法包括低溫抑制法、液體石蠟法、干燥法等[5]。可見，在今后開發頑拗性種子保存方法的過程中，借鑒人工種子的保存技術，如包埋技術，不失為一種有效的選擇。

1.3 其他種子

除了頑拗型種子外，海草由于其生長環境的特殊性，種子的保存液也與一般植物不同。申請人為中國科學院海洋研究所的公開專利CN107593687A公開了一種川蔓草種子保存的方法。通過將川蔓草種子果皮腐爛后洗凈，浸泡在滅菌高鹽人工海水中，于0℃低溫避光保存。川蔓草具有重要的生態價值，是越冬食草候鳥和底棲無脊椎動物的重要食物資源，并且能夠改變河口海岸帶棲息地的水質質量。然而，川蔓草幼苗由于無法抵御夏季的干燥和冬季的寒冷，成苗率很低。而上述專利中的保存方法解決了川蔓草種子的長期保存問題，為川蔓草資源保護工作提供了技術支持。從頑拗性種子和海草的保存液設計過程中可以看出，結合植物的自然生長環境以及種子對惡劣環境的耐受能力是選擇保存液組分的重要原則。

2 花粉的保存

花粉包含有其物種的所有基因類型，具有豐富的遺傳多樣性，是種質保存和交換的重要材料。但是一般情況下，花粉壽命很短，這給授粉帶來了極大困難。采用低溫或超低溫保存的方法能夠大大延長花粉的保存時間，避免病蟲害的引入，為種質交換提供方便。花粉與種子類似，對凍存前的含水量有一定的要求，如，銀杏花粉的含水量低于12.7%時，凍存于液氮中仍能存活，花粉含水量高于20%時，萌發率與生活力均顯著下降。但是也有對水量要求不高的植物，如芍藥、梅花多個品種的花粉超低溫保存時無需任何脫水處理[6]。申請人為廣東省農業科學院蔬菜研究所的公開專利CN110249800A公開了一種苦瓜花粉的收集和保存方法。其發明點在于，收集開花前1d的花蕾，人工干燥使花藥開裂，過篩除雜后在4℃或-80℃條件下保存。上述方法保存的花粉相比于開花后收集的花粉萌發率顯著提高。申請人為山東省農業科學院蔬菜花卉研究所的公開專利CN108651444A公開了一種蝴蝶蘭花粉保存及育種方法，根據花粉的使用需求，不同的保存期限對應不同的保存溫度，1～7d內使用的在18～25℃下暫存，8～60d內使用的放置在4℃的冰箱內保存，60d后使用的保存在-20℃的冷凍室內。蝴蝶蘭為觀賞花卉，為了繁育出更多外形性狀的品種，需要進行雜交處理。上述專利克服了現有技術中蝴蝶蘭雜交工作效率不高、雜交后需要去除母本花粉團造成花粉浪費、對于部分花期不遇的品種無法進行雜交等缺點。上述專利中，主要目的是起到對花粉的轉移作用，所保存的花粉多在當年當季使用，因此，僅采用室溫保存和常規低溫保存。

一些植物的花粉并不適合采用常規的低溫保存方法。例如，羅漢果花粉壽命自然條件下僅1～2d，家用冰箱貯藏也不超過5d?，F有技術中，羅漢果生產上一般100株雌株配置3～5株雄株，由于氣候變化等影響，有時會遇到雌、雄株不同時開花或雄株開花量不滿足授粉需求的問題。因此，需要有雄株花粉儲備才能滿足生產需要。申請人為桂林吉福思羅漢果有限公司的公開專利CN109362718A公開了一種羅漢果花粉超低溫貯藏的方法，將羅漢果花粉常溫下用硅膠或無水氯化鈣干燥24～72h，直至花粉含水量為10%～40%，裝入凍存管密封后，轉入-86℃超低溫冰箱或-196℃液氮中貯藏。上述方法克服了羅漢果花粉短缺以及常規方法貯存期限短的問題，噻唑藍染色顯示，超低溫保存的花粉解凍后人工授粉的結實率顯著高于家用冰箱(-18～20℃)保存的花粉。

3 植物莖尖和芽的保存

植物莖尖和芽的保存通常需要預培養，如果只使用凍存保護劑，不能保證細胞或組織具有較高的存活率，許多莖尖分生組織即便使用凍存保護劑，細胞或組織也不能存活。預培養的目的是增加細胞分裂與分化的同步化,減少細胞內自由水的含量,使細胞能經受低溫脅迫。如，在B5培養基中附加5%DMSO、5%葡萄糖，在4℃預培養2d，可提高白花三葉草莖尖分生組織的存活率。此外，低溫鍛煉也是保證凍存效果的有效方法，可激活植物體內的抗寒機制。如，經-30～-50℃低溫訓練的蘋果枝條，其葉芽在液氮中保存2a仍可存活[7]。預培養和低溫鍛煉均可視作正式冷凍條件的預適應，即相比于正式冷凍條件更為溫和的脫水條件和溫度。莖尖處理的降溫方法有慢凍法、快凍法、玻璃化法、包裹/脫水法、包裹/玻璃化法等多種，上述方法各有利弊，需要研究人員結合實際的設備條件、凍存材料的數量、凍存保護劑的毒性作用等因素進行針對性地選擇。中國農業科學院作物科學研究所的專利CN109221094A公開了一種香蕉離體莖尖超低溫保存方法。將香蕉苗置于蔗糖培養基中預培養2d，隨后剝取莖尖，經裝載液裝載后，利用玻璃化溶液PVS2于0℃下處理50min(相當于低溫訓練)，在液氮中蘸一下后迅速裝入盛滿液氮的冷凍管，浸入液氮保存。所述方法克服了現有技術采用田間保存結合離體試管苗保存，人力、物力、財力耗費大的缺陷。

4 新動態

目前，種質資源保存方法主要著眼于新機制方面的研究、精細化保存等方法。如，申請人為上海交通大學的專利CN109619094A公開了一種百子蓮SK3脫水素蛋白在降低細胞脅迫傷害及改善超低溫保存效果中的應用。上述方法跳出了傳統的超低溫保存手段從減少冰晶生成的角度進行改進的思路，轉而以種質資源超低溫保存過程中可能遭遇的ROS氧化脅迫為切入點，尋找具有更優保護效果的抗氧化劑。解決了現有技術中種質資源超低溫保存后生長率恢復不佳的問題。沈陽藥科大學的專利CN114128437A、CN114128438A中公開適合苦參、石柱參的保存方法，從中可以得出只有對具體種子種質資源的條件進行優化研究，建立良種種源基地，才能提高具體種質資源的質量。種質資源精細化保存是建立良種種質資源庫的關鍵。另外，對于離體資源的保存，筆者認為可以從低溫保護劑出發，將領域內新低溫保護劑如納米碳點、微米顆粒、液體金屬等用于保存種質資源，以期提高復蘇率。

5 總結與期望

本文主要種子、花粉、莖尖、芽等不同類型的種質資源的保存方法進行歸納。普通種子和頑拗性種子均可采用投入液氮的方式保存，區別在于，凍存前的干燥過程普通種子能夠干燥至較低的含水量，而頑拗性種子由于不耐干燥，凍存前的含水量較高，如何避免冰晶對種子的損傷是需要主要考慮的問題。因此，對于降溫程序的調節(如快速冷凍)以及凍存保護劑的選擇顯得尤為重要?；ǚ圩鳛榉N質資源凍存時不必準備凍存保護液，只需干燥后冷凍即可，操作簡便，且體積小便于跨區域種質資源的運輸與交流。莖尖和芽相對而言生理狀態更為脆弱，通常需要預培養和低溫鍛煉才能夠獲得理想的保存效果。

習總書記強調，只有用自己的手攥緊中國種子，才能端穩中國飯碗，才能實現糧食安全。我們應該加大對種子自主知識產權的保護，加大自主創新。盡管現有技術已經提供了豐富的種質資源保存方法，然而，目前針對瀕危、珍稀植物的保存仍然是逐一嘗試，效率較低。未來可以共建共享平臺，在共享庫中錄入植物共性數據，經過大數據分析，生成優選的保存方案，實現高效保存。另外，需盡快完善種質質量評估體系和相關技術標準，合理布局，構建良種種質資源庫。