響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助酶法提取石榴皮多糖的工藝

程 朗，陳紅玲，徐蓓蓓，武進(jìn)雨，趙蘇源

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

0 引言

石榴果實(shí)美味可口，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，石榴的根、花、果實(shí)、果皮、種子等均可作為藥材[1]，石榴皮具有澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲等一些藥理作用[2]，石榴皮中含有豐富的化學(xué)成分，主要有鞣質(zhì)、沒食子酸、黃酮類及多糖類物質(zhì)，含有生物堿、甾類、蛋白質(zhì)類化合物等[3]。石榴皮多糖具有生物活性免疫調(diào)節(jié)[4]、抗腫瘤[5]、抗菌抗病毒[6]等臨床醫(yī)學(xué)作用，還有降血脂、降血糖[7]、保護(hù)肝臟等保健作用。石榴皮中黃酮、多酚類物質(zhì)研究較為廣泛，如研究總黃酮[8]、多酚含量[9]及抗氧化能力等。然而，關(guān)于優(yōu)化多糖提取過(guò)程的報(bào)道卻很少。其中，安徽懷遠(yuǎn)生產(chǎn)的石榴最為出名[10]，每年有大量石榴及相關(guān)制品產(chǎn)出，因此會(huì)產(chǎn)出大量的石榴皮渣和石榴種子等副產(chǎn)品，為避免資源浪費(fèi)，可充分利用被丟棄的石榴皮進(jìn)行深入研究。采用響應(yīng)面優(yōu)化石榴皮多糖提取工藝，最終能夠有效地提高石榴皮多糖得率，為開發(fā)利用石榴皮提供試驗(yàn)依據(jù)，提高石榴皮資源的利用價(jià)值。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

懷遠(yuǎn)石榴，購(gòu)自安徽懷遠(yuǎn)縣當(dāng)?shù)厮袌?chǎng)。

試劑：纖維素酶、果膠酶、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，上海源葉生物科技有限公司提供；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、蒽酮、濃硫酸、均為國(guó)產(chǎn)分析純，國(guó)藥集團(tuán)提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

XM-250UVF 型超聲波清洗機(jī)，小美超聲儀器昆山有限公司產(chǎn)品；Multiscan Go 型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司產(chǎn)品；1706 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Hettich 公司產(chǎn)品；JRA-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品；BSA124S 型電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；pH818型pH 計(jì)，?，攦x表產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 工藝流程

稱取石榴皮粉末→稱取纖維素酶、果膠酶→加入蒸餾水→調(diào)節(jié)pH 值→復(fù)合酶解提取→滅酶（80℃，15 min）→超聲輔助處理→離心取上清液（轉(zhuǎn)速5 500 r/min，時(shí)間10 min）→4 倍量醇沉→低溫靜置過(guò)夜→離心（轉(zhuǎn)速5 500 r/min，時(shí)間10 min）→取沉淀得到多糖待測(cè)品[16]。

2.2 操作要點(diǎn)

①酶解。稱取1 g 石榴皮粉，加入復(fù)合酶0.3 g（纖維素酶與果膠酶之比為1∶1），根據(jù)不同料液比，加入不同量的蒸餾水，用1 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至6，放置在50 ℃水浴中酶解。②滅酶。在80 ℃水浴中滅酶15 min。③超聲。根據(jù)設(shè)定的不同超聲時(shí)間、溫度、功率，放至超聲清洗機(jī)里進(jìn)行超聲處理。④測(cè)糖。對(duì)超聲處理液進(jìn)行離心處理，取上清液，加入4 倍量體積的80%乙醇溶液，4 ℃下過(guò)夜，離心取沉淀，最后用蒸餾水溶解沉淀，采用蒽酮-硫酸法測(cè)糖的含量。

2.3 多糖含量的測(cè)定

結(jié)合蒽酮-濃硫酸法[11]測(cè)定初始提取物中多糖含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取1 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.2，1.6 mL 分別置于試管中，加蒸餾水至2 mL，從中移取1 mL 置具塞比色管中，分別加入2 mg/mL 蒽酮-硫酸溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）1 mL，混勻，沸水浴10 min，冰水浴冷卻至室溫，在波長(zhǎng)620 nm 處測(cè)吸光度。橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)分別為葡萄糖濃度和吸光度，以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=0.008 1X+0.082 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 7。

多糖得率的測(cè)定：取1 mL 經(jīng)稀釋后的多糖溶液，按照上述方法，反應(yīng)完成后，于波長(zhǎng)620 nm 下進(jìn)行吸光度的測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算多糖得率[13]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 不同料液比對(duì)多糖得率的影響

稱取1 g 石榴皮粉，按照不同料液比（1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60）加入蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，調(diào)pH 值6.0，在50 ℃下酶解1 h，結(jié)束后在80 ℃下滅酶15 min，接著在溫度70 ℃，功率為225 W 條件下超聲處理60 min。

2.4.2 不同酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

稱取1 g 石榴皮粉，加入30 mL 蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，調(diào)pH 值6.0，在50 ℃下按照不同酶解時(shí)間（30，60，90，120，150 min）酶解，結(jié)束后在80 ℃滅酶15 min，接著在溫度70 ℃，功率為225 W 條件下超聲處理60 min。

2.4.3 不同酶解pH 值對(duì)多糖得率的影響

稱取1 g 石榴皮粉，加入30 mL 蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，按照不同酶解pH 值（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）進(jìn)行調(diào)節(jié)，在50 ℃酶解1 h，結(jié)束后在80 ℃下滅酶15 min，接著在溫度70 ℃，功率為225 W 條件下超聲處理60 min。

2.4.4 不同酶解溫度對(duì)多糖得率的影響

稱取1 g 石榴皮粉，加入30 mL 蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，調(diào)pH 值6.0，按照不同酶解溫度（30，40，50，60，70 ℃）酶解1 h，結(jié)束后在80 ℃滅酶15 min，接著在溫度70 ℃，功率為225 W 條件下超聲處理60 min。

2.4.5 不同超聲溫度對(duì)多糖得率的影響

取1 g 石榴皮粉，加入30 mL 蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，調(diào)pH 值6.0，在50 ℃下酶解1 h，結(jié)束后在80 ℃下滅酶15 min，接著按照不同超聲溫度（40，50，60，70，80 ℃），功率為225 W 條件下超聲處理60 min。

2.4.6 不同超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

取1 g 石榴皮粉，加入30 mL 蒸餾水，加入纖維素酶和果膠酶，調(diào)pH 值6.0，在50 ℃下酶解1 h，結(jié)束后在80 ℃下滅酶15 min，接著在溫度70 ℃，功率為225 W 條件下按照不同超聲時(shí)間（30，40，50，60，70 min）處理。

2.4.7 不同超聲功率對(duì)多糖提取率的影響

2.4.8 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取影響較大的因素，以多糖得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-behnken 設(shè)計(jì)原理，通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 不同料液比對(duì)多糖得率的影響

由于溶劑的比例會(huì)影響溶液的黏度和濃度，從而影響多糖的傳質(zhì)擴(kuò)散。因此，選取5 個(gè)不同水平的料液比進(jìn)行影響多糖得率的考查。

不同料液比對(duì)多糖得率的影響見圖2。

圖2 不同料液比對(duì)多糖得率的影響

由圖2 可知，在料液比1∶20～1∶30（g∶mL）時(shí)，多糖得率逐步增大。繼續(xù)增加料液比，多糖得率開始逐漸下降，這是由于溶劑過(guò)多，不利于多糖的濃縮[14]。并且在后續(xù)乙醇浸提時(shí)，乙醇用量也隨之增加，從而導(dǎo)致在離心處理時(shí)會(huì)浪費(fèi)更多提取物。因此，料液比最適比例為1∶30（g∶mL）。

3.1.2 不同酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

渥巴錫之仲兄作為人質(zhì)死于阿斯特拉罕，史載明確。具體拘禁之地、死亡之地，未留下史載，但人質(zhì)不是普通的囚犯，將薩賴安置在作為當(dāng)年阿斯特拉罕衙署所在地的小克里姆林宮、居住在這座白色大樓里，似也不失是一種合理的推測(cè)。若如此，小克里姆林宮也是土爾扈特人又一處傷心之地。

由于底物用量固定，酶解時(shí)間會(huì)有一個(gè)最適值。因此，選取5 個(gè)不同的酶解時(shí)間梯度進(jìn)行多糖得率的考查。

不同酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響見圖3。

圖3 不同酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

由圖3 可知，在30～60 min 內(nèi)，多糖得率逐漸升高。當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到1 h 時(shí)，多糖得率最大，而隨時(shí)間逐漸加長(zhǎng)，多糖得率不再有上升的趨勢(shì)，這可能是由于在反應(yīng)初期階段，酶與一定量的底物已經(jīng)完全反應(yīng)，后期增加反應(yīng)時(shí)間也無(wú)法繼續(xù)提高得率。因此，最適酶解時(shí)間定為60 min。

3.1.3 不同酶解pH 值對(duì)多糖得率的影響

纖維素酶和果膠酶的最適酶解pH 值為中性偏酸。因此，選取5 個(gè)不同的酶解pH 值梯度進(jìn)行影響多糖得率的考查。

不同酶解pH 值對(duì)多糖得率的影響見圖4。

圖4 不同酶解pH 值對(duì)多糖得率的影響

由圖4 可知，當(dāng)酶解pH 值到達(dá)6 時(shí)，多糖得率最高，隨后開始降低，這是由于pH 值已經(jīng)超過(guò)上述2 種酶的最適pH 值，造成酶活降低，從而影響多糖得率。因此，酶解最適pH 值為6。

3.1.4 不同酶解溫度對(duì)多糖得率影響

酶活性對(duì)溫度的要求較高，因此設(shè)置5 個(gè)不同的酶解溫度梯度考查其對(duì)多糖得率的影響。

不同酶解溫度對(duì)多糖得率的影響見圖5。

圖5 不同酶解溫度對(duì)多糖得率的影響

由圖5 可知，在溫度為50 ℃時(shí)，酶分解能力最佳，多糖得率達(dá)到峰值，隨后溫度升高，2 種酶開始逐漸失活，多糖得率也開始降低。因此，最適酶解溫度為50 ℃。

3.1.5 不同超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

超聲時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)提取得率也有一定影響，因此設(shè)置5 個(gè)不同的超聲時(shí)間梯度考查其對(duì)多糖得率的影響。

不同超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響見圖6。

圖6 不同超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

由圖6 可知，超聲時(shí)間為30～60 min 時(shí)，多糖得率數(shù)值隨時(shí)間增加而逐漸攀升，當(dāng)達(dá)到60 min 后，多糖得率開始下降，這可能是由于超聲波長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械振動(dòng)和切割作用[15]，導(dǎo)致其中多糖成分遭到破壞。從而造成多糖得率降低。因此，超聲處理最佳時(shí)間為55～65 min。

3.1.6 不同超聲溫度對(duì)多糖得率的影響

合適的超聲溫度可以保護(hù)樣品中的有效成分免遭破壞。

不同超聲溫度對(duì)多糖得率的影響見圖7。

圖7 不同超聲溫度對(duì)多糖得率的影響

由圖7 可知，在超聲溫度為40～70 ℃時(shí)，多糖得率隨溫度升高而逐漸增大，而多糖是活性物質(zhì)，當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能會(huì)遭到破壞，多糖得率反而降低。因此，最適超聲溫度為65～75 ℃。

3.1.7 不同超聲功率對(duì)多糖得率的影響

不同超聲功率輔助提取細(xì)胞中多糖物質(zhì)溶出的效果不同。

不同超聲功率對(duì)多糖得率的影響見圖8。

圖8 不同超聲功率對(duì)多糖得率的影響

由圖8 可知，超聲功率在225 W 以下時(shí)，隨著超聲功率增大，石榴皮多糖的提取效果越來(lái)越好，當(dāng)超聲功率超過(guò)225 W 后，多糖得率開始逐漸降低，因此，最適超聲功率為200～250 W。

3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

3.2.1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)

根據(jù)對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，選取對(duì)石榴皮多糖得率影響較為顯著的3 個(gè)榴皮多糖得率影響較為顯著的3 個(gè)因素，即超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化石榴皮多糖的最佳提取工藝。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

3.2.2 響應(yīng)面結(jié)果及其方差分析

響應(yīng)面設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合[15]，得到響應(yīng)面擬合方程：

式中：Y——石榴皮總多糖得率，%。

擬合二次多項(xiàng)式模型方差分析見表3。

由表3 可知，此模型（Model）的F 值為23.37，均方差p=0.000 2＜0.01，說(shuō)明該試驗(yàn)響應(yīng)面擬合方程回歸模型極為顯著；失擬項(xiàng)p=0.200 8＞0.05，說(shuō)明失擬度在統(tǒng)計(jì)意義上不顯著，即表明模型擬合度較好，綜合以上分析，說(shuō)明可使用該模型對(duì)石榴皮總多糖得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。另外，由表3 還可知，模型的一次項(xiàng)A、B、C 及二次項(xiàng)A2、B2、C2的p 值均小于0.01，為極顯著水平，交互項(xiàng)AB 的p 值小于0.05，達(dá)到顯著水平，其余項(xiàng)均不顯著。根據(jù)F 值的大小，各因素對(duì)石榴皮多糖的影響順序依次為超聲溫度（B）＞超聲時(shí)間（A）＞超聲功率（C）。

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型方差分析

3.2.3 響應(yīng)面三維圖形分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，用響應(yīng)面軟件分析得到三維曲面圖及等高線圖。通過(guò)觀察曲面的傾斜程度和等高線的形狀分析各因素變量間的交互作用。

超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖見圖9，超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖見圖10，超聲溫度和超聲功率對(duì)多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖見圖11。

圖9 超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖

圖10 超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖

圖11 超聲溫度和超聲功率對(duì)多糖得率影響的三維曲面圖和等高線圖

由圖9 可知，曲面圖曲線彎曲程度高，說(shuō)明超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)響應(yīng)值影響大，等高線形狀呈橢圓形，結(jié)合方差分析結(jié)果，說(shuō)明超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用影響顯著。

由圖10 可知，曲面圖曲線彎曲程度較圖9 來(lái)說(shuō)，彎曲程度不是很高，說(shuō)明超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)響應(yīng)值影響不大，等高線形狀已開始接近圓形，結(jié)合方差分析結(jié)果，說(shuō)明超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用影響不顯著。

由圖11 可知，曲面圖曲線彎曲程度較前兩張圖來(lái)說(shuō)，彎曲程度不是很高，說(shuō)明超聲溫度和超聲功率對(duì)響應(yīng)值影響不大，等高線形狀約近于圓形，結(jié)合方差分析結(jié)果，說(shuō)明超聲功率和超聲溫度的交互作用影響不顯著。

3.2.4 模型的優(yōu)化與驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)響應(yīng)面模型的優(yōu)化，得到了提取石榴皮多糖條件的最佳方案為超聲時(shí)間60.87 min，超聲溫度71.61 ℃，超聲功率223.98 W，在此條件下，得到理想的最佳多糖得率為7.618%?？紤]到實(shí)際操作條件的可行性，對(duì)試驗(yàn)最佳方案進(jìn)行如下調(diào)整：超聲時(shí)間為61 min，超聲溫度為72 ℃，超聲功率為225 W。根據(jù)調(diào)整后方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，設(shè)置3 組平行，得到石榴皮多糖得率平均值為7.53%，與理論值7.618%相比，相對(duì)誤差為0.088%，結(jié)果與理論值非常接近，說(shuō)明模型擬合效果較好，結(jié)果可靠性較高。

4 結(jié)論

采用纖維素酶和果膠酶協(xié)同處理石榴皮粉末樣品進(jìn)行多糖提取，可以有效地使植物細(xì)胞分離、破裂，從而提高石榴皮多糖得率。同時(shí)，結(jié)合超聲波加速提取技術(shù)，并運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，得到優(yōu)化后的提取工藝條件為料液比1∶30（g∶mL），pH 值6，酶解時(shí)間1 h，酶解溫度50 ℃，超聲時(shí)間61 min，超聲溫度72 ℃，超聲功率225 W。在此提取條件下，石榴皮總多糖得率為7.53%。與優(yōu)化前的單因素試驗(yàn)結(jié)果相比，石榴皮多糖得率明顯得到提高。與傳統(tǒng)單一的提取方法相比，此優(yōu)化方法實(shí)用可靠，可用于石榴皮多糖提取。