豐花玫瑰干花蕾中總黃酮的提取工藝優(yōu)化

朱雅婧，孫 瑤，李 武，趙付安

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所,河南 鄭州 450002）

0 引言

玫瑰（Rosa rugosa）為薔薇科薔薇屬落葉觀花灌木，具有觀賞價值、食用價值和藥用價值，是一種經(jīng)濟(jì)價值較高的植物資源。玫瑰以花蕾入藥，可活血消炎、行氣解郁[1-2]。玫瑰花含有多種微量元素、氨基酸及黃酮類活性物質(zhì)等，所制成的花茶香氣濃郁、滋味甘美，且具有調(diào)血理氣、美容養(yǎng)顏的功效，深受女性的喜愛[3-5]。豐花玫瑰產(chǎn)自山東平陰，是平陰玫瑰研究所培育的藥用重瓣玫瑰，花大豐產(chǎn)、色彩鮮艷、香味濃郁，被國家輕工部規(guī)定為可食用玫瑰品種[6-7]。玫瑰花茶富含黃酮類化合物，黃酮是玫瑰花中最重要的活性成分之一，可有效清除氧自由基，具有抗氧化作用，可阻止細(xì)胞退化衰老[8-10]。黃酮類化合物具有多種醫(yī)療保健功能，能夠抑制紅細(xì)胞溶血和脂質(zhì)過氧化過程，具有體外抗補(bǔ)體作用，且具有抗炎、鎮(zhèn)痛的功效[11-13]，是國際上開發(fā)新藥物的研究重點。

目前，雖有較多關(guān)于黃酮提取的報道，但未見豐花玫瑰干花蕾中黃酮的相關(guān)研究。因此，以豐花玫瑰干花蕾為研究對象，采用有機(jī)溶劑浸潤法對其總黃酮進(jìn)行提取，并對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為有效開發(fā)利用豐花玫瑰提供理論依據(jù)，同時為玫瑰黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐花玫瑰花蕾，摘自河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地，80 ℃下烘干，粉碎（60 目），密封備用。

氫氧化鈉、硝酸鋁、硝酸鈉、乙醇，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，Solarbio，貨號SR8250-100 mg。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī)，德國Sigma 公司產(chǎn)品；金屬浴，金銀杏生物科技（北京）有限公司產(chǎn)品；移液槍，德國Eppendorf 產(chǎn)品；智能超聲波清洗機(jī)，廣東固特超聲股份有限公司產(chǎn)品；Epoch 酶標(biāo)儀，美國Bio Tek 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 總黃酮的提取

將80 ℃烘干的豐花玫瑰花蕾粉碎，過60 目篩。精準(zhǔn)稱取一定質(zhì)量的花蕾干粉，按照相應(yīng)料液比加入70%乙醇，于漩渦振蕩器上搖勻，放置于65 ℃金屬浴提取60 min，每隔5 min 振蕩搖勻1 次，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心20 min，取上清液按照1.3.3蘆丁標(biāo)注曲線測定方法測定吸光度。每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.2 黃酮提取工藝條件優(yōu)化

采用單因素試驗，分別分析花茶和乙醇的料液比（1∶20，1∶40，1∶60，1∶80，1∶100，1∶120）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%，60%，70%，80%，90%，100%）、溫浴溫度（45，55，65，75，85，95 ℃）、提取時間（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，）4 個條件對所提取黃酮產(chǎn)率的影響。各試驗重復(fù)3 次。

1.3.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取50 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加入70%乙醇充分溶解并定容至25 mL，配置質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的蘆丁溶液。取一定體積的蘆丁溶液，加蒸餾水稀釋10 倍，最終配成0.2 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，現(xiàn)用現(xiàn)配。移液槍準(zhǔn)確吸取蘆丁0.2 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液0，20，40，60，80，100 μL，分別置于干凈的1.5 mL棕色離心管中，依次加入70%乙醇100，80，60，40，20，0 μL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉25 μL，搖勻黑暗靜置6 min。加入10%硝酸鋁25 μL，搖勻黑暗靜置6 min。最后加入5%氫氧化鈉200 μL，70%乙醇150 μL，體系終體積500 μL，搖勻，置于黑暗處靜置15 min。使用96 孔板合理布板，每個樣品設(shè)置3 個重復(fù)點板，測定樣品波長510 nm 處的吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合方程為吸光度=0.003 5×蘆丁質(zhì)量濃度，R2=0.996，表明線性關(guān)系良好。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4 黃酮總含量的測定

黃酮含量測定參照王剛等人[16]的測定方法，并進(jìn)行改進(jìn)。按照1.3.3 的測定方法，測定不同提取條件下提取液波長510 nm 處吸光度。將吸光值代入對標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的線性方程，計算得到黃酮在500 μL 測定體系中的質(zhì)量濃度，繼而得到黃酮質(zhì)量和在原提取液中的總質(zhì)量，通過計算，最終得到黃酮產(chǎn)率。

式中：OD510——消除背景后波長510 nm 處吸光度；

V1——加乙醇后原提取液的體積，μL；

k——蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

V2——測吸光度時從原提取液中吸取的體積，μL；

m——所稱取干花蕾的質(zhì)量，μg。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對黃酮產(chǎn)率的影響

控制提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，溫浴溫度65 ℃，提取時間60 min，分別在花蕾體積質(zhì)量和乙醇比為1∶10，1∶20，1∶40，1∶60，1∶80，1∶100，1∶150，1∶200，1∶300（μg∶μL）的條件下提取豐花玫瑰干花蕾中的總黃酮。以黃酮產(chǎn)率為考查指標(biāo)，探索料液比對豐花干花蕾總黃酮提取率的影響，選取最適液料比。

不同料液比對黃酮產(chǎn)率的影響見圖2。

圖2 不同料液比對黃酮產(chǎn)率的影響

由圖2 可知，料液比為20～100 μg/μL 時，黃酮產(chǎn)率隨著料液比的增大逐漸而增大，100 μg/μL時黃酮產(chǎn)率達(dá)到最大，之后隨著提取溶劑的增加黃酮產(chǎn)率下降。因此，料液比為100 μg/μL時豐花玫瑰干花蕾總黃酮提取效果較好。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮產(chǎn)率的影響

控制提取條件為料液比1∶100，溫浴溫度65 ℃，提取時間60 min，分別在提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，60%，70%，80%，90%，100%的條件下提取豐花干花蕾中的總黃酮。以黃酮產(chǎn)率為考查指標(biāo)，探索乙醇體積分?jǐn)?shù)對豐花干花蕾總黃酮提取率的影響，選取最適乙醇體積分?jǐn)?shù)。

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮產(chǎn)率的影響見圖3。

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮產(chǎn)率的影響

由圖3 可知，黃酮產(chǎn)率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先升高后下降，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，黃酮產(chǎn)率達(dá)到最高。由此可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，豐花玫瑰干花蕾總黃酮提取效果較好。

2.3 溫浴溫度對黃酮產(chǎn)率的影響

控制提取條件為料液比1∶100（μg∶μL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時間60 min，設(shè)置溫浴溫度為45，55，65，75，85，95 ℃，分別在不同溫浴溫度下提取豐花干花蕾中的總黃酮。以黃酮產(chǎn)率為考查指標(biāo)，探索溫浴溫度對豐花干花蕾總黃酮提取率的影響，選取最適溫浴溫度。

不同溫浴溫度對黃酮產(chǎn)率的影響見圖4。

圖4 不同溫浴溫度對黃酮產(chǎn)率的影響

由圖4 可知，黃酮產(chǎn)率隨著溫浴時間的增長逐漸升高，55～65 ℃時黃酮產(chǎn)率顯著增大，隨后趨于穩(wěn)定，95 ℃時黃酮產(chǎn)率稍有下降。因此，溫浴溫度為75 ℃時，既能節(jié)約能源又能保證豐花玫瑰干花蕾總黃酮提取效果。

2.4 提取時間對黃酮產(chǎn)率的影響

控制提取條件為料液比1∶100（μg∶μL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，溫浴溫度75 ℃，分別在提取時間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h 的條件下提取豐花干花蕾中的總黃酮。以黃酮產(chǎn)率為考查指標(biāo)，探索提取時間對豐花干花蕾總黃酮提取率的影響，選取最適提取溫度。

不同提取時間對黃酮產(chǎn)率的影響見圖5。

由圖5 可知，黃酮產(chǎn)率隨著提取時間的增長先升高后下降，提取時間為1.5 h 時，黃酮產(chǎn)率達(dá)到最高，達(dá)到6.50%。由此可見，提取時間為1.5 h 時，豐花玫瑰干花蕾總黃酮產(chǎn)率最高。

圖5 不同提取時間對黃酮產(chǎn)率的影響

3 結(jié)論

黃酮類化合物近年來成為研究熱點，目前已有關(guān)于大蔥[14]、蕪菁[15]、苦水玫瑰花渣[16]、玫瑰茄[17]、板栗殼[18]等植物的總黃酮提取工藝的研究。植物總黃酮提取方法主要有超聲波提取法、溶劑提取法、微波提取法及超聲波-微波協(xié)同提取法等[19-22]。有機(jī)溶劑提取法相比于其他方法而言成本低、耗時短、效率高，對儀器設(shè)備要求簡單，易實現(xiàn)生產(chǎn)應(yīng)用，也是目前使用較為廣泛的提取方法。

玫瑰花的附加價值很大程度上與其含有的黃酮類成分有著重要關(guān)聯(lián)。采用有機(jī)溶劑浸潤法對豐花玫瑰花蕾的總黃酮進(jìn)行提取，并通過單因素試驗對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，提取條件為料液比1∶100（μg∶μL），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，溫浴溫度75 ℃，提取時間1.5 h 時，豐花玫瑰干花蕾總黃酮產(chǎn)率最高，達(dá)到6.50%。優(yōu)化后的提取工藝，有效地提高了豐花玫瑰干花蕾中總黃酮的產(chǎn)率，具有很好的應(yīng)用價值。因此，研究為綜合開發(fā)利用玫瑰資源提供了理論依據(jù)，同時為玫瑰花黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。