新疆紅棗中總黃酮的提取及抗氧化活性研究

朱焱超，涂世偉，于夢瑤， 張春蘭，2

（1.塔里木大學食品科學與工程學院，新疆阿拉爾 843300；2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300）

紅棗（Ziziphus jujube Mill.）又稱中華大棗、華棗，可藥食兩用，具有極高的營養價值，有補胃健脾、補血益氣、潤肺止咳、鎮靜安眠、減輕毒性、提高免疫力等功效[1]。

紅棗中富含黃酮、皂苷、色素、各種維生素和抗氧化酶等活性成分[2-5]。其中，黃酮類化合物具有多種生物保健功能，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗血管增生和抗病毒等作用[6]。黃酮類化合物難溶于水，易溶于有機溶劑和稀堿溶液，提取黃酮的工藝包括溶劑提取法[7]、超臨界提取法[8]、微波輔助提取法[9]、堿溶酸沉法[10]、超聲輔助提取法[11]等。因此，紅棗黃酮的提取可提高農副產品的經濟效益，對紅棗資源的綜合利用具有重要意義。

采用超聲輔助乙醇溶液提取紅棗中的黃酮類化合物，以乙醇體積分數、料液比、超聲時間、超聲溫度4 個因素為影響提取的條件，研究紅棗中黃酮類化合物體外抗氧化活性，為新疆紅棗資源進一步開發和利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

駿棗，市售；蘆?。?8%）、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、DPPH（1,1 -二苯基-2 -三硝基苯肼）、Tris（三羥甲基氨基甲烷）等，均為國產分析純。

1.1.2 儀器與設備

TGL-20B 型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產品；J6 型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司產品；RE-3000 型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠產品；Biolog ELx808TM 型多功能酶標儀，Biotek Instruments 公司產品；Lab-1C-80 型真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理

紅棗，清洗、去核，于55 ℃下烘干，粉碎后60 目過篩，4 ℃下冷藏保存。稱取適量紅棗粉，根據單因素試驗提取紅棗中黃酮類化合物，提取液以轉速4 000 r/min 離心10 min，收集上清液濃縮冷凍干燥，備用。

1.2.2 標準曲線的繪制

配制質量濃度為0.4 mg/mL 的蘆丁標準液，取0，1，2，3，4，5 mL 置于25 mL 容量瓶中，加入質量分數為5%的NaNO2溶液1 mL，混勻靜置6 min；加入質量分數為10%的Al（NO3）3溶液1 mL，混勻靜置6 min；加入質量分數為4%的NaOH 溶液10 mL，體積分數為60%的乙醇溶液定容，混勻靜置15 min，于波長510 nm 處測定吸光度[12]。以蘆丁溶液的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程Y=10.814X+0.006 8，R2=0.999 6。

1.2.3 單因素試驗設計

分別以乙醇體積分數40%，50%，60%，70%，80%；料液比（g∶mL）1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30；超聲時間10，20，30，40，50 min；超聲溫度30，40，50，60，70 ℃作為條件提取黃酮類化合物，于波長510 nm 處測定提取液吸光度，根據標準曲線計算提取液中黃酮類化合物質量濃度，每組試驗平行3 次，求平均值。

1.2.4 總黃酮含量測定

將提取液稀釋后，于波長510 nm 處測定吸光度，根據標準曲線線性方程計算樣品中黃酮含量。

式中：C——稀釋后黃酮提取液的質量濃度，mg/mL；

V——提取液體體積，mL；

n——稀釋倍數；

W——樣品質量，g。

1.2.5 DPPH 自由基清除能力的測定

配制濃度為0.1 mmol/L 的DPPH 溶液，避光30 min；總黃酮提取液凍干，配制質量濃度分別為2，4，6，8，10 mg/mL 的黃酮提取液。

取不同質量濃度黃酮提取液與DPPH 溶液按1∶3的比例混合，避光30 min，于波長517 nm 處測定其吸光度A1；測定不同質量濃度黃酮提取液與無水乙醇混合液的吸光度A2，DPPH 溶液與無水乙醇混合液的吸光度A0[13]。按公式（2）計算DPPH 自由基清除率。

1.2.6 羥自由基清除能力的測定

取1 mL 不同質量濃度黃酮提取液，按順序加入濃度為0.006 mol/L 的FeSO4溶液1 mL、0.006 mol/L的H2O2溶液1 mL、0.006 mol/L 水楊酸-乙醇溶液1 mL，混勻后，37 ℃下水浴30 min，于波長510 nm處測定吸光度A1；其他操作條件不變，用去離子水替換H2O2溶液，于波長510 nm 處測定吸光度A2；其他操作條件不變，用去離子水替換黃酮提取液，于波長510 nm 處測定吸光度A0[4]。按公式（3）計算羥自由基清除率。

1.2.7 超氧陰離子清除能力的測定

配制pH 值8.2，濃度0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液、0.005 mol/L 鄰苯三酚溶液、10 mol/L HCl 溶液。分別取Tris-HCl 緩沖溶液5 mL，在25 ℃恒溫水浴鍋中預熱15 min，按順序加入不同質量濃度黃酮提取液2 mL、鄰苯三酚溶液1 mL，混合搖勻，在25 ℃下水浴8 min，加入2 滴HCl 溶液終止反應，以去離子水做參比溶液，于波長320 nm 處測定吸光度A1；其他操作條件不變，用去離子水替換鄰苯三酚溶液，于波長320 nm 處測定吸光度A2；其他操作條件不變，用去離子水替換黃酮提取液，于波長320 nm 處測定吸光度A0[14]。按公式（4）計算超氧陰離子清除率。

1.2.8 Fe2+還原能力的測定

配制pH 值6.6，0.2 mol/L 磷酸緩沖液、1%鐵氰化鉀溶液、10%三氯乙酸溶液、1%三氯化鐵溶液。取不同質量濃度黃酮提取液1 mL，按順序加入磷酸緩沖液1 mL、鐵氰化鉀溶液1 mL，50 ℃下水浴20 min后，加入三氯乙酸溶液1 mL，以轉速3 000 r/min 離心10 min，取上清液1 mL，加入去離子水1 mL、三氯化鐵溶液0.2 mL，混勻放置10 min，于波長700 nm處測定吸光度，以空白試劑作為參比液，吸光度越大，則說明對Fe2+的還原能力越強。

1.2.9 ABTS 自由基清除能力的測定

別呦呦是個很怪的人。她心情好的時候，像水一樣，能把我融化了，心情不好的時候，就發火，無緣無故地發火。問她為什么這樣？她說，我沒靈感，一句詩寫不出來，你說我能不來火嗎？

配制0.007 mol/L ABTS 溶液、0.002 45 mol/L 過硫酸鉀溶液，按1∶1 混合配制ABTS 自由基母液，在避光靜置16 h，于波長734 nm 處，乙醇稀釋，將ABTS 自由基母液吸光度控制在0.7±0.02，取0.4 mL不同質量濃度黃酮提取液，加入ABTS 自由基稀釋液3 mL，避光靜置30 min，于波長734 nm 處測定吸光度A1；其他操作處理條件不變，將ABTS 自由基稀釋液替換成去離子水，測定吸光度A2；其他操作處理條件不變，將黃酮提取液替換成無水乙醇，測定吸光度A0[15]。以相同濃度的抗壞血酸作陽性對照。按公式（5）計算紅棗黃酮提取液的ABTS 自由基清除率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對紅棗總黃酮提取量的影響

乙醇體積分數對紅棗總黃酮提取量的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分數對紅棗總黃酮提取量的影響

由圖1 可知，乙醇體積分數為40～60%時，總黃酮提取量呈上升趨勢；乙醇體積分數高于60%，總黃酮提取量呈下降趨勢，總黃酮提取量在60%乙醇體積分數時提取率最高。這可能是因為乙醇體積分數越高，醇溶性雜質、色素及親脂性強的組分浸出量會增加，導致總黃酮類化合物提取率下降。

2.1.2 料液比對紅棗總黃酮提取量的影響

料液比對紅棗總黃酮提取量的影響見圖2。

圖2 料液比對紅棗總黃酮提取量的影響

由圖2 可知，在料液比為1∶25（g∶mL）時達到最高，隨著溶劑體積的增大，總黃酮提取量降低。這可能是因為適當增加溶劑體積，總黃酮提取量增加；當提取溶劑的體積到達一定值時，總黃酮提取量就會達到飽和，隨著溶劑體積增大，可能溶出了其他醇溶性的雜質，影響顯色反應降低吸光度。

2.1.3 超聲時間對紅棗總黃酮提取量的影響

超聲時間對紅棗總黃酮提取量的影響見圖3。

圖3 超聲時間對紅棗總黃酮提取量的影響

由圖3 可知，其他單因素條件不變，紅棗總黃酮的提取量在超聲時間10～40 min 內呈上升趨勢，當超聲時間超過40 min，總黃酮提取量降低，總黃酮提取量在超聲40 min 時提取效果最佳。這可能是因為紅棗總黃酮隨著超聲時間變長，能在提取溶劑中充分析出，當超聲時間到達一定值時，超聲時間過長會使本身具有抗氧化性的黃酮類化合物部分氧化，會使得提取量變低。

2.1.4 超聲溫度對紅棗總黃酮提取量的影響

超聲溫度對紅棗總黃酮提取量的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對紅棗總黃酮提取量的影響

由圖4 可知，其他單因素提取條件不變，紅棗總黃酮提取量隨著超聲溫度升高而逐漸增大，當超聲溫度超過60 ℃后，總黃酮提取量呈下降趨勢，提取效果在60 ℃達到最佳。溫度升高，會促進分子的運動加快，從而促進黃酮類化合物溶出；溫度超過60 ℃后，過高的溫度可能會破壞黃酮類物質的分子結構，同時可能促使其他雜質溶出，故總黃酮提取量會受到影響。

綜上所述，選取在超聲溫度60 ℃，料液比1∶25（g∶mL），乙醇體積分數60%，超聲時間40 min條件下提取紅棗總黃酮，紅棗總黃酮提取量可達到2.36 mg/g。

2.2 抗氧化活性試驗結果

2.2.1 紅棗總黃酮對DPPH 自由基的清除作用

紅棗總黃酮對DPPH 自由基的清除作用見圖5。

由圖5 可知，紅棗總黃酮提取液質量濃度為2～10 mg/mL 內時，對DPPH 自由基的清除效果呈上升趨勢，質量濃度為10 mg/mL 時清除率最高為76.89%，表明紅棗總黃酮提取液對DPPH 自由基具有明顯的清除效果。

圖5 紅棗總黃酮對DPPH 自由基的清除作用

2.2.2 紅棗總黃酮對羥自由基的清除作用

紅棗總黃酮對羥自由基的清除作用見圖6。

圖6 紅棗總黃酮對羥自由基的清除作用

羥自由基是在人體新陳代謝過程中產生毒性與危害最大的一種自由基，其可以使組織的糖類、氨基酸、蛋白質、核酸等物質遭受氧化性損傷和破壞，導致細胞壞死或突變。由圖6 可知，紅棗總黃酮提取液對羥自由基的清除率隨著樣液質量濃度增大而上升，在10 mg/mL 時清除率最高為65.71%，紅棗總黃酮提取液具有一定的抗清除羥基自由基能力。

2.2.3 紅棗總黃酮對超氧陰離子的清除作用

紅棗總黃酮對超氧陰離子的清除作用見圖7。

圖7 紅棗總黃酮對超氧陰離子的清除作用

由圖7 可知，在質量濃度為2～10 mg/mL 時，紅棗總黃酮提取液對超氧陰離子的清除作用隨著質量濃度增大而增加，在10 mg/mL 時達到最大57.17%，表明紅棗總黃酮提取液本身對超氧陰離子具有較好清除能力。

2.2.4 紅棗總黃酮對Fe2+的還原能力測定

紅棗總黃酮對Fe2+的還原能力測定見圖8。

圖8 紅棗總黃酮對Fe2+的還原能力測定

由圖8 可知，隨著紅棗總黃酮提取液質量濃度變大，吸光度增加，這表明紅棗總黃酮提取液對Fe2+的還原能力隨著紅棗總黃酮質量濃度增大而增強，表明紅棗總黃酮提取液對Fe2+具有較好的還原能力。范艷麗等人[12]研究的紅棗核總黃酮對Fe2+的還原能力，紅棗核總黃酮在0.1～0.5 mg/mL 質量濃度范圍內的吸光度在0.1～0.4，還原能力且隨質量濃度增大而提升至穩定。試驗中紅棗總黃酮提取液與參考中的紅棗核總黃酮對Fe2+的還原能力相近時，質量濃度不同，說明試驗中可能紅棗總黃酮提取液純度太低，且紅棗果肉總黃酮與紅棗核總黃酮差異比較大。

2.2.5 紅棗總黃酮對ABTS 自由基的清除作用

紅棗總黃酮對ABTS 自由基的清除作用見圖9。

圖9 紅棗總黃酮對ABTS 自由基的清除作用

由圖9 可知，紅棗總黃酮提取液對ABTS 自由基的清除率與樣液質量濃度呈正比例關系，在質量濃度為1 g/mL 時，清除率達到了最高為82.19%，表明紅棗總黃酮提取液對ABTS 自由基有較好清除效果。范艷麗等人[12]研究紅棗核總黃酮對ABTS 自由基的清除能力，紅棗核總黃酮在0.1～0.5 mg/mL 質量濃度范圍內對ABTS 自由基的清除率最高達到91%，且隨濃度增加而顯著提高紅棗總黃酮提取液清除ABTS 自由基能力增強。

3 結論

通過單因素試驗，確定以超聲溫度60 ℃，料液比1∶25（g∶mL），乙醇體積分數60%，超聲時間40 min 條件下提取紅棗總黃酮，研究了該提取方法對提取紅棗總黃酮影響，紅棗總黃酮提取量可達到2.360 mg/g。通過紅棗總黃酮提取液對DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子、ABTS 自由基的清除效果及鐵離子的還原能力進行考查，紅棗總黃酮提取液具有一定的抗氧活性，隨著提取液質量濃度增大而增加，在質量濃度為10 mg/mL 時，DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子的清除率達到最高，分別為76.89%，65.71%，57.17%，在質量濃度為1 mg/mL時對ABTS 自由基清除率為82.19%。

試驗所得為紅棗總黃酮提取液為粗提物，含有較多其他雜質。紅棗作為新疆的特色果品，可尋求更多的開發途徑將紅棗資源充分開發利用，試驗研究結果可為紅棗的進一步深加工開發提供一定的參考依據。