高效液相色譜法測定復合果汁飲品中 茶氨酸的含量

程 倩，馮雪萍，陳 昭，李春陽，張 雪，張海波*

（1.安琪紐特股份有限公司，湖北宜昌 443003；2.酵母功能湖北省重點實驗室，湖北宜昌 443003）

茶氨酸又名N-乙基-γ-L-谷氨酰胺[1]，是茶葉中特有的非蛋白氨基酸，也是茶葉中含量最高的游離氨基酸，占茶葉中游離氨基酸總量的50%左右[2]。自然界中存在的茶氨酸均為L型，純品為白色針狀結晶，極易溶于水，不溶于乙醇和乙醚[3-4]。茶氨酸化學性質較穩定，將其溶液煮5 min或將其溶于pH 3.0的溶液中，并于25 ℃下儲放12個月，茶氨酸含量能保持不變[5]。工業上生產茶氨酸的方法主要有茶愈傷組織培養法、茶葉提取法、化學合成法以及微生物酶法等[6-9]。茶氨酸具有甜味和鮮爽味，是茶葉鮮爽味的主要成分，味覺閾值為0.06%，即使在含量較低的情況茶氨酸也可以被感覺到[10]。

茶氨酸是一種安全、無毒、具有多種生理功能的食品添加劑，可抑制苦味物質，改善食品的風味，被廣泛用于飲料、點心、糖果、果凍等各類食品和膳食補充劑中[11-13]。此外，茶氨酸具有多種生理功能，如增強免疫、抗腫瘤、降血壓、減肥、抗疲勞以及緩解焦慮、改善睡眠、提高認知等作用[14-16]。2014年7月，茶氨酸被國家衛計委批準為新食品原料。近年來，隨著茶氨酸生理活性研究的逐漸深入，其在國內外功能性食品中的應用也日益增長[17-20]。

茶氨酸的定量分析方法主要有堿式碳酸銅沉淀法、非水滴定法、紙色譜法、薄層色譜法、分光光度法、氨基酸自動分析儀法、毛細管電泳法、傅立葉變換近紅外光譜法、離子對色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法以及液質聯用法等[21-23]，但實踐中發現這些方法對某些成分復雜的樣品進行測定時受干擾較大。本實驗建立高效液相色譜法測定復合果汁飲品中的茶氨酸，以期能夠達到快速、準確的分析要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復合果汁飲品，安琪紐特股份有限公司提供。

茶氨酸對照品，純度99%，上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈為色譜純。

1.2 儀器與設備

1260 II 配備1260 Infinity Ⅱ蒸發光散射檢測器，美國Agilent公司；XS205DU分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；SB25-12DT超聲儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq（4.6 mm×250 mm， 5 μm）或等效柱；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1； 進樣量：10 μL；檢測波長：210 nm；流動相A：100%純水；流動相B：乙腈；梯度洗脫條件見 表1。

表1 梯度洗脫條件表

1.3.2 溶液配制

稀釋劑/空白溶液：純水溶液。

對照品儲備溶液：精密稱取茶氨酸對照品 10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加稀釋劑溶解，定容，渦勻，0.45 μm微孔濾膜過濾。

對照品工作液：分別精密量取一定體積的對照品儲備液，以稀釋劑稀釋定容，配制成濃度為 0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、 0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1和0.20 mg·mL-1的系列標準工作液。

對照品溶液：精密量取對照品儲備溶液 0.1 mL，加稀釋劑稀釋定容至1 mL，配制成對照品濃度為0.1 mg·mL-1溶液。

空白輔料溶液：精密量取空白輔料原溶液1 mL（提前搖勻），置于10 mL容量瓶中，加入適量稀釋劑，超聲，定容，渦勻，0.45 μm微孔濾膜過濾。

輔料加標溶液：精密量取空白輔料原溶液 0.1 mL，對照品儲備溶液0.1 mL，加稀釋劑定容至 1 mL，配制成對照品濃度為0.1 mg·mL-1溶液。

供試品溶液：取供試品1 mL（提前搖勻），置于10 mL量瓶中，加入適量稀釋劑，超聲，定容，渦勻，0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.3.3 標準曲線繪制

分別量取相應體積的對照品儲備液，加入稀釋劑，配制成含茶氨酸0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、 0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1和 0.20 mg·mL-1的線性系列溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品實際濃度為橫坐標（x），以峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 流速的選擇

取供試品溶液，在不同流速0.6 mL·min-1、 0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1和1.2 mL·min-1條件下，對茶氨酸分離情況進行了研究，結果表明，流速為 1.0 mL·min-1時，檢測運行時間短，茶氨酸色譜峰與其他共存組分能很好分離，且峰形較好，因此色譜流速選擇1.0 mL·min-1。

2.2 標準曲線

由圖1可知，茶氨酸線性方程為y=4 661.579x-3.113，R2為1.000，茶氨酸在0.01～0.20 mg·mL-1線性關系良好。

圖1 茶氨酸的標準曲線圖

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性實驗

取空白溶液、空白輔料溶液、對照品溶液、輔料加標溶液和供試品溶液，按照1.3.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。實驗結果表明，茶氨酸的保留時間為3.75 min，空白溶液和空白輔料溶液在目標峰保留時間處均無干擾；對照品溶液、輔料加標溶液、供試品溶液中相對應的目標峰的保留時間相差0.002，未超過±0.2 min范圍。供試品溶液中目標峰與相鄰峰之間分離度大于1.5，專屬性良好。色譜圖見圖2。

圖2 茶氨酸色譜圖

2.3.2 加標回收率

精密稱取同一批次的復合果汁飲品9份，于棕色容量瓶中，分別加入不同體積的對照品儲備液，稀釋劑定容，渦勻，配制成80%、100%、120% 3個濃度的樣品加標溶液，茶氨酸理論濃度分別為 0.104 mg·mL-1、0.131 mg·mL-1、0.157 mg·mL-1，每個濃度平行配制3份，過濾，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由表2可知，9份樣品加標溶液中目標物的回收率在98.2%～99.4%，滿足《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[24]要求。

表2 加標回收率實驗結果表

2.3.3 精密度

稱取6份供試品，按照1.3.2項，配制成6份供試品溶液，過濾，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由表3可知，6份供試品溶液茶氨酸含量的RSD為1.5%，滿足《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）要求。

表3 精密度實驗結果表

2.3.4 定量限和檢測限

本實驗采用信噪比法，取0.10%對照品溶液和0.05%對照品溶液，按照1.3.1項下色譜條件，記錄色譜圖。實驗結果表明，0.10%對照品溶液中茶氨酸主峰的S/N分別為10.4、11.7、13.5；0.05%對照品溶液中茶氨酸主峰的S/N分別為5.6、6.0、6.3，符合定量限和檢測限實驗信噪比法的要求，因此定量限為0.001 mg·mL-1，檢測限為0.000 5 mg·mL-1。

2.3.5 溶液穩定性

取對照品和供試品溶液分別于室溫放置0 h、6 h、12 h、18 h、26 h和36 h進樣，記錄色譜圖。由表4可知，對照品溶液在36 h內，茶氨酸的峰面積為0 h峰面積的99.5%～100.5%，溶液穩定性良好；供試品溶液在36 h內，茶氨酸的峰面積為0 h峰面積的95.6%～103.7%，溶液穩定性良好，均滿足《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》要求（GB/T 27404—2008）。

表4 溶液穩定性實驗結果表

2.3.6 耐用性

取對照品溶液、供試品溶液，在1.3.1項色譜條件基礎上，分別調整柱溫和柱流速，柱溫調整范圍為±5 ℃，柱流速調整范圍為±10%。各色譜條件下，對照品溶液第一針色譜圖中，目標峰的拖尾因子均為1.2；連續進樣3針，柱溫30 ℃時茶氨酸峰面積的RSD為0.01%，柱溫40 ℃時茶氨酸峰面積的RSD為0.18%，流速0.9 mL·min-1時茶氨酸峰面積的RSD為0.13%，流速1.1 mL·min-1時茶氨酸峰面積的RSD為0.17%，滿足《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[13]要求，耐用性良好。

2.3.7 樣品測定結果

稱取6份復合果汁飲品，對其茶氨酸含量進行了測定，樣品檢測結果見表5。檢測值與該產品的標示值的相對偏差在0.77%～3.85%，符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）要求。

表5 樣品檢驗結果表

3 結論

本研究建立了一種高效液相色譜法測定復合果汁飲品中茶氨酸的含量的方法。流動相為100%純水和乙腈，梯度洗脫，最佳檢測條件為柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1。本方法樣品只需稀釋便可直接進樣分析，茶氨酸的保留時間3.75 min，與其他色譜峰分離良好，具有簡便、快速、準確的特點，易于推廣。