中性粒細胞胞外誘捕網在膀胱癌中的研究進展△

徐希，張振聲，許傳亮

海軍軍醫大學第一附屬醫院泌尿外科，上海 200433

膀胱癌（bladder cancer，BC）是世界范圍內常見的泌尿系統惡性腫瘤之一，2019年BC在美國男性惡性腫瘤患者中占6%，其發病率居全部惡性腫瘤第4位[1]。超過70%的BC患者表現為非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC），其余為肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC），兩者的術后復發率均超過20%[2]。中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular trap，NET）于2004年首次被發現，是一種主要由中性粒細胞釋放的網狀結構[3]。腫瘤微環境中的中性粒細胞可通過釋放NET影響腫瘤生長，這種機制在BC中很常見[4]。本文對NET的構成和功能及其對BC作用的研究進展進行綜述。

1 NET的構成和功能

中性粒細胞是宿主對細菌和真菌感染的第一道免疫防御屏障，在炎癥和免疫反應中發揮重要作用[5]。中性粒細胞受到外界刺激幾分鐘后，逐漸出現核小葉減少、染色質聚集、核膜內外層分離、細胞質內顆粒解體。然后核膜分裂成小泡，細胞核和細胞質融合，細胞體積縮小，細胞膜破裂，釋放NET[6]。NET的釋放過程被稱為中性粒細胞胞外誘捕網凋零（neutrophil extracellular trap apoptosis，NETosis），可由多種藥物和促炎介質誘導[7]，其中白細胞介素（interleukin，IL）-8是人類中性粒細胞發生NETosis最顯著的誘導趨化劑[8-9]。

NET由DNA組成松散骨架，其成分還包括基質 金 屬 蛋 白 酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、組織蛋白酶G（cathepsin G，CG）和髓樣過氧化物酶（myeloid peroxidase，MPO）等[10]。NET可能通過激活淋巴細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞導致組織損傷、自身免疫性疾病和慢性炎癥疾病[11]。除了作為一種防御機制來捕獲和殺死原核微生物，NET還參與了多種人類疾病的發生過程，包括血栓形成、痛風和膽結石等[12]。

2 NET對腫瘤的作用

NET被證明具有抗腫瘤和促腫瘤兩種相互對立的作用[13]。NET的重要成分MPO和NE釋放并進入腫瘤細胞后，可使磷脂酰肌醇3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）的活躍程度發生改變，影響腫瘤細胞信號轉導，高濃度的MPO和NE對腫瘤細胞具有細胞毒性，減少其釋放會導致NET功能由抗腫瘤向促腫瘤轉化[14]。在小鼠惡性腫瘤模型中，多種實驗方法已證實NET的形成在促進腫瘤轉移、喚醒休眠的腫瘤細胞和介導免疫抑制方面發揮作用[15-16]。一方面，在腫瘤微環境中NET會產生大量趨化因子，保護轉移性腫瘤細胞免受免疫介導的細胞毒性的影響[17]；另一方面，NET具有很強的黏附性，可以吸附病原體和血小板，在腫瘤細胞轉移過程中提供了促進腫瘤細胞黏附的血管內網絡[18]。

NET促進腫瘤轉移主要通過5個步驟來完成[19]：①NET降解細胞外基質，如MMP9和CG可以降解腫瘤細胞外基質，為腫瘤轉移做準備[20]。②NET捕獲循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC），使這些細胞從原發腫瘤部位或轉移部位脫落進入循環系統，從而逃避免疫攻擊[21]。③NET促進免疫逃逸，如NET可以在免疫細胞和CTC之間形成屏障，NET及其溶解產物也能夠抑制體內免疫細胞的正常功能，從而協助CTC逃避免疫識別[22]。④NET可通過調節鈣黏蛋白破壞血管壁完整性，使腫瘤細胞外溢，促進腫瘤細胞向遠處器官轉移[23]。⑤NET可促進血管生成，NET中的各種組件如MMP9、CG和NE可以誘導血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達，促進腫瘤生長、轉移和血管生成[24]。

3 NET在BC治療中的作用

BC被認為是高度免疫原性惡性腫瘤，中性粒細胞對免疫系統具有抑制和激活雙重作用，反映宿主的炎癥和免疫反應[25]。Nie等[26]研究認為，調節性細胞死亡（regulatory cell death，RCD）在BC的發生發展中具有重要作用，RCD通路受到各種內外環境的刺激，在各種信號分子的控制下誘導細胞死亡或允許細胞存活，從而影響腫瘤進展或治療效果，其中NET的作用尤其重要。Liu等[27]研究發現，BC微環境中存在大量的中性粒細胞浸潤，高濃度的NET浸潤與不良結局相關。de Andrea等[28]將MPO、瓜氨酸化組蛋白、IL-8蛋白和CD8+T細胞共染色，采用多重免疫熒光法識別人類腫瘤組織中的NET，通過此方法發現BC中NET密度與IL-8蛋白表達呈正相關，與CD8+T細胞密度呈負相關。這些結果均說明NET可能在BC進展和治療方面發揮作用。

3.1 NET與膀胱內卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）灌注治療

膀胱內BCG灌注已成為NMIBC最有效的免疫治療方法，可有效降低術后復發率和腫瘤進展率[29]。然而，BCG相關的不良反應和不耐受限制了其應用，因此了解膀胱內BCG灌注對腫瘤的作用機制可以為BC的免疫治療提供新的策略[30]。中性粒細胞是BCG免疫治療有效的必要條件，多形核 中 性 粒 細 胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）是人類固有免疫的第一道防線，是膀胱內BCG灌注治療后出現的主要白細胞亞群[31]。BCG誘導的NET有助于抑制腫瘤細胞生長，特別是在使用BCG的初期，在BCG、炎癥因子和腫瘤細胞存在的情況下，活化的PMN可以刺激自噬途徑并釋放NET，自噬還能調節NET的形成，誘導活性氧和NET的產生[32]。

在BCG治療過程中，PMN的生物功能包括促進細胞運動、增殖和生存等，其產生的各種細胞因子、趨化因子和NET通過影響其他免疫細胞或腫瘤細胞，在炎癥和免疫反應中發揮重要作用，并在BCG治療的早期形成腫瘤免疫微環境（tumor immune microenvironment，TIME）[33]。Liu等[34]研究發現，BCG誘導的NET具有雙重效應，具體包括NET的直接效應和NET刺激的間接效應，NET的直接效應通過細胞毒性作用、誘導細胞凋亡、阻止細胞周期進程、抑制腫瘤細胞向膀胱環境遷移等表現出來，而間接效應是NET通過刺激免疫反應、募集T細胞和巨噬細胞阻止腫瘤生長。

3.2 NET與BC的放射治療

超過40%的侵襲性BC患者傾向于選擇非手術治療，如放射治療表現出良好的腫瘤治療效果[35]。Menon等[36]研究發現，BC患者的TIME在放射治療中具有關鍵作用。輻射引起的炎癥會導致中性粒細胞快速進入TIME，免疫細胞的浸潤和促炎細胞因子的釋放可以在長時間內維持免疫反應，通過形成NET影響腫瘤進展[37]?；诜派渲委熁颊叩木植棵庖叻磻?，循環中性粒細胞的持續高濃度也與BC患者的預后相關[38]。

Shinde-Jadhav等[39]研究使用相同腫瘤基因型的小鼠BC模型，發現在接受放射治療的小鼠TIME中NET沉積增加，通過抑制NET可以改善整體輻射反應。在體外，高遷移率族蛋白B1（high mobility group box B1，HMGB1）可促進NET形成；在體內，抑制HMGB1和NET均可顯著延緩腫瘤生長。而在部分BC患者中觀察到NET，這些患者對放射治療沒有反應，并且在放射治療后BC持續進展。這些發現確定了NET可以作為提高放射治療療效的潛在靶點，進一步探索NET在放射治療中的作用及與腫瘤相關蛋白的相互作用是有必要的，可以確定放射治療的時機。

4 NET在BC治療中的作用機制

腫瘤分級、臨床分期、淋巴管和血管擴張等常被作為BC的預后指標。然而，目前使用的預后標志物在預測腫瘤進展、復發、轉移和治療反應方面作用有限[40]。NET與CD15、MPO和瓜氨酸化組蛋白H3共同染色后可被明顯觀察到，在BC的進展過程中NET可被定量地檢測[28]。因此，對組織和血清中的NET進行動態評估可為BC治療效果的預測提供依據。

NETosis過程可在不同水平上進行治療性阻斷，例如IL-8可以被單克隆抗體中和，C-X-C趨化因子受體（C-X-C motif chemokine receptor，CXCR）1/2抑制劑可以延緩NETosis，這些研究正在進行臨床試驗[41-42]。應用NET的抑制劑或降解劑治療腫瘤正在被探索，例如肽基精氨酸脫亞氨酶4（peptidyl arginine decoagulase 4，PAD4）能夠將精氨酸轉化為瓜氨酸，從而引起染色質發生變化，而PAD4缺乏的中性粒細胞不能產生NET[43]。這些研究說明根據NET的發生機制研究治療腫瘤的靶向藥物是可行的且具有廣闊的前景。

5 小結

綜上所述，NET在腫瘤的發生和治療中具有重要作用，但目前關于NET在BC治療中作用的研究還較少，主要局限在放射治療和BCG灌注治療方面，通過靶向NET改善BC患者預后將成為未來的重要研究方向，未來還需要更多的研究來闡明NET在BC發生發展中的作用。