白菜型冬油菜NAC基因家族鑒定及表達分析

王會文， 范軍強， 路曉明， 曾 瑞， 武軍艷， 劉麗君， 馬 驪， 蒲媛媛， 孫萬倉， 李學才

(1.甘肅農業大學農學院，甘肅蘭州730070；2.省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室，甘肅蘭州730070)

關鍵字： 白菜型冬油菜；NAC轉錄因子；家族分析；非生物脅迫；表達分析

氣候變化是當今人類面臨的重大風險挑戰，荒漠化不僅威脅著全球生態環境，而且對各個國家和地區的經濟發展產生重大影響。中國北方大多數地區為干旱半干旱氣候，冬季寒冷干燥，這種氣候和人類活動的影響更容易使土地荒漠化[1]，21世紀以來，全球土地荒漠化現象正在日益加劇，在中國北方地區尤其明顯。隴油系列白菜型冬油菜可以在寒冷干旱的惡劣環境中正常越冬[2]，擁有豐富的抗逆基因，使油菜的分布范圍更加廣泛，可以在北緯48°的阿勒泰等地區種植[3]。與此同時，白菜型冬油菜增加了中國北方地區的復種指數，提高了當地土地利用率和糧油產量[4]，使油菜不僅可以作為傳統的油料作物，還可以作為冬季覆蓋作物。在北方干旱寒冷區域大面積種植冬油菜可以增加土壤覆蓋率，同時有效防止土地沙漠化，減少沙塵天氣[5]，對改善生態環境具有重要作用。隨著生物信息學的不斷發展和對白菜型冬油菜基因組測序的完成，挖掘白菜型冬油菜中儲存的基因信息，以闡明植物生長發育機制、各種逆境脅迫機理，并利用其豐富的抗逆基因增強作物抵御環境脅迫的能力，為今后培育適應性更強的品種提供理論依據。

植物在長期適應外界多變的環境過程中，自身形成了響應逆境脅迫的防御體系，其本質就是通過內部的基因表達，使植物在復雜的環境中調節體內生化代謝途徑和生長發育進程來適應外界環境變化[6]。轉錄因子作為蛋白質，可以與目的基因啟動子或增強子的區域相互作用來調控基因的表達[7]，從而發揮其生物學功能。NAC(NAM、ATAF1/2、CUC2)是植物特有的最大的轉錄因子基因家族之一，NAC蛋白結構由高度保守的N端和可變的C端(TR)組成，N端分為A、B、C、D、E 5個亞結構域[8]，不同亞結構域發揮著不同的作用。其中，C、D高度保守，負責與目標靶基因的DNA序列識別并結合，B、E則保守性較弱，和C端功能相似，一起促成其功能的多樣性；亞結構域A可以形成二聚體，和DNA結合有關[9]。NAC轉錄因子蛋白通常與植物細胞內膜結合在一起，當植物受到外界不利環境信號刺激后，與NAC轉錄因子蛋白結合的受控蛋白被水解，然后NAC蛋白進入細胞核[10]。NAC蛋白結構域N端的亞結構域可形成二聚體，與DNA結合形成穩定的結構，調控靶基因啟動子區基因的表達[9]。NAC轉錄因子的這種調節方式可以使植物迅速對外界環境作出反應，有利于為植物的生長發育創造良好的內部環境。NAC家族成員廣泛分布在植物中，成員多達100個以上[11-13]。NAC蛋白結構域C端具有高度可變的轉錄調控區，在不同的條件下具有不同的轉錄特性，從而激活或抑制不同的轉錄過程[14]，為其參與調控植物的生長發育、器官衰老、果實成熟、各種非生物脅迫防御等提供條件[15]。

在番茄中，NAC轉錄因子基因SlNAM1與合成乙烯的2個關鍵基因SlACS2和SlACS4的啟動子結合并激活其表達[16]，促進了乙烯的合成，而SlNAM1突變體則延遲番茄的成熟；PdeNAC是赤松纖維素合成酶合成的關鍵基因，促進了赤松次生細胞壁的形成和管胞分化，增加了煙草和擬南芥次生細胞壁的沉積[17]；擬南芥轉錄因子基因NAC103在種子萌發和幼苗生長過程中被上調[18]，其編碼蛋白質對脫落酸敏感，并正向調節多個脫落酸(ABA)應答下游基因，提高了擬南芥種子的發芽率。在調控植株衰老過程中，ANAC087和ANAC046具有協同作用，通過控制擬南芥根冠程序性死亡來促進植株的衰亡，ANAC087通過核酸酶BFN1降解根部細胞的染色質[19]，ANAC046通過內含子順式作用元件和相關蛋白質的修飾主動調控細胞程序性死亡。馬鈴薯StNAC053基因在擬南芥中過量表達，上調相關基因，增強了超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的活性，增加了轉基因擬南芥對干旱的耐受力[20]；最近研究發現，辣椒CaNAC55基因的表達受ABA的抑制[21]，而在水稻中，NAC轉錄因子ONAC066能抑制合成脫落酸基因的表達，積累更高的可溶性糖、氨基酸含量，提高水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性[22]，表明NAC家族基因與ABA代謝基因具有拮抗作用，并且NAC家族基因在生物脅迫中也發揮作用。迄今為止，白菜型冬油菜NAC轉錄因子家族在白菜型冬油菜中還未見報道。

本研究擬利用白菜型冬油菜基因組測序數據和生物信息學手段挖掘并分析白菜型冬油菜NAC基因家族成員的基本信息、系統進化、共線性復制關系，通過對2個不同品種白菜型冬油菜在低溫脅迫下生長錐中BraNAC家族基因表達量的預測，并應用實時熒光定量PCR技術對2個耐旱性、抗寒性不同的白菜型冬油菜幼苗中候選BraNAC基因的表達量進行檢測，然后篩選抗逆基因，以期為后續全面解析白菜型冬油菜NAC基因家族成員對多種逆境脅迫響應的機制奠定基礎，同時，一些BraNAC成員可以作為候選基因，為增強油菜的耐旱性和抗寒性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的白菜型冬油菜試驗材料隴油7號和Lenox由甘肅農業大學油菜課題組提供。隴油7號和Lenox均為白菜型冬油菜，其中，隴油7號具有強抗寒性和抗旱性，而Lenox的抗寒性和抗旱性較弱。

1.2 試驗設計

試驗在2021年3月至10月進行，將隴油7號和Lenox種子種植在花盆中，每盆4株，使種子在室外自然條件下生長，待植株長到5～6葉期，分別對2種材料進行脅迫處理。低溫處理，將植株移入4 ℃低溫培養箱(光照14 h，黑暗10 h)，同時對同一批次的幼苗進行干旱脅迫處理(18%聚乙二醇)，處理后0 h(CK)、1 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h收集幼苗的根和葉，立即放入液氮中速凍，之后保存于-80 ℃冰箱中備用，每個處理3次生物學重復。

1.3 白菜型冬油菜NAC家族成員的生物信息學分析

1.3.1 白菜型冬油菜全基因組的鑒定 白菜型冬油菜隴油7號基因組序列文件由甘肅農業大學油菜課題組提供；用Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org)下載NAM隱馬爾可夫結構模型PF02365，使用HMMER搜索可能存在的NAC轉錄因子家族序列，并除去冗余。利用在線軟件SMART(https://www.omicsclass.com/article/681)和NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)對已獲取的NAC蛋白進行結構域預測，最終得到含有保守BraNAC結構域的基因序列。同時，使用在線軟件ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)對所有家族成員氨基酸序列的氨基酸數量、相對分子質量、等電點、親水性、脂肪指數等進行預測。利用Plant-mPLoc( https://www.omicsclass.com/article/1438)預測NAC家族蛋白質的亞細胞定位。

1.3.2NAC基因家族系統進化樹 基于已有候選基因家族蛋白質氨基酸序列全長，利用相鄰接(Neighbor-joining)法在MEGA7軟件中構建進化樹，參數為默認值。

1.3.3NAC基因的染色體定位、共線性關系和啟動子順式作用元件分析 用所得NAC家族信息繪制基因在染色體上的位置圖，同時用TBtools繪制共線性圖；提取白菜型冬油菜候選BraNAC基因上游1 500 bp啟動子序列，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)數據庫分析順式作用元件，并繪制相關圖表。

1.3.4 白菜型冬油菜NAC基因結構及保守模型分析 利用已有白菜型冬油菜NAC基因家族DNA和蛋白質編碼區(CDS)序列，使用GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)繪制內含子-外顯子結構圖；根據NAC基因ID從基因組注釋文件中提取注釋信息，搜索獲得的家族成員的蛋白質結構域，利用MEME在線軟件(http://meme-suite.org)分析BraNAC家族的保守基序，參數設置為在所有序列中最多找到15個、motif長度為6～50個氨基酸。使用TBtools軟件繪制基因結構和保守模型圖。

1.3.5 低溫脅迫下BraNAC家族的表達預測 利用白菜型冬油菜隴油7號和Lenox的生長錐中BraNAC基因在冷脅迫時的表達數據，篩選出BraNAC家族基因的表達量，使用TBtools軟件繪制熱圖。

1.3.6 RNA提取及熒光定量PCR 樣品使用天根生化科技(北京)有限公司RNAprep pure Plant Kit植物總RNA提取試劑盒提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶，利用PrimeScript RTrea-gent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒[寶生物工程 (大連) 有限公司產品]進行反轉錄，得到單鏈cDNA，置于-20 ℃冰箱保存備用。利用實時熒光定量PCR技術檢測BraNAC基因的表達情況，所用引物見表1。各個樣品檢測重復3次，所得的數據采用2-△△Ct方法計算分析，以Actin內參基因作為對照。利用TBtools軟件繪制表達熱圖。

表1 實時熒光定量RT-qPCR引物序列

2 結果與分析

2.1 白菜型冬油菜家族成員的鑒定

利用生物信息學分析方法從白菜型冬油菜全基因組中進行BLAST比對，除去冗余，通過結構域確認，最終得到119個NAC家族成員，根據E-value值從小到大的順序，依次命名為BraNAC001～BraNAC119(表2)。BraNAC家族蛋白的相對分子質量、氨基酸數、脂肪指數等分析結果顯示，BraNAC家族基因編碼的氨基酸數量差異明顯，最多的是BraNAC027，可編碼658個氨基酸，最少的是BraNAC036，僅編碼142個氨基酸；脂肪指數為43.68～84.04，表明脂肪鏈在蛋白質氨基酸序列中所占比重較高，蛋白質均為脂溶性蛋白質；等電點最小的是BraNAC023編碼的蛋白質(4.47)，最大的是BraNAC083編碼的蛋白質(9.54)，既有酸性氨基酸，又有堿性氨基酸；親水性指數為-6.060～-0.280，為親水性蛋白質；相對分子質量為16 529.18～71 967.59；亞細胞定位預測結果表明，BraNAC家族蛋白質成員在細胞中分布廣泛，大部分分布在細胞核、細胞質和葉綠體中，BraNAC006、BraNAC015、BraNAC021、BraNAC067、BraNAC083定位在線粒體中，BraNAC050、BraNAC108定位在質膜上，BraNAC119定位在高爾基體中。在液泡、過氧化物體和細胞骨架中都發現了BraNAC家族蛋白，表明白菜型冬油菜NAC轉錄因子家族成員可能在不同亞細胞結構中具有不同的功能。

表2 BraNAC基因編碼的蛋白質理化性質

2.2 BraNAC家族基因系統進化分析

由圖1可知，119個白菜型冬油菜NAC家族成員被分為8個亞族。各亞族基因數目不一，第Ⅷ亞家族成員最少，僅包括5個基因，分支也較少，說明第Ⅷ亞家族基因同源性強；第Ⅵ和第Ⅰ亞家族數目最多，各包括25個家族成員，第Ⅰ亞家族分支數比第Ⅵ亞家族多，說明第Ⅰ亞家族的結構較為多樣；BraNAC040在亞家族Ⅱ中的一級分支上，該基因可能行使亞家族Ⅱ的最基本功能；并且各個亞家族之間各級分支數、各分支基因數目不相同，表明每一個亞家族在同源結構域相同的情況下，還存在一些短的特異序列，這些序列可能為BraNAC家族功能多樣性奠定結構基礎。

圖1 BraNAC基因家族系統進化樹

2.3 BraNAC基因家族染色體定位

由圖2可以看出，BraNAC家族基因在10條染色體上都有分布，且在每條染色體上的數目各不相同。其中，3號染色體上分布的BraNAC基因數最多，有21個；在4號和8號染色體上分布的BraNAC基因數最少，各有4個；9號染色體最長，含有10個BraNAC家族成員。在1號、2號、3號、5號、6號、7號、10號染色體上含有較多BraNAC基因，距離較近。有31個(占比：26.05%)基因形成了13個串聯基因簇，表明串聯重復在BraNAC家族的擴展中發揮著重要作用。

矩形表示串聯重復基因。

2.4 BraNAC基因家族共線性復制關系分析

基因復制在生物體進化中發揮重要作用，復制的基因為植物個體的生理和形態變化奠定基礎[23]。為了探究白菜型冬油菜NAC家族基因的串聯重復關系，通過序列比對篩選BraNAC基因家族存在串聯重復的基因，結果如圖3所示。對119個BraNAC家族成員進行復制鑒定，發現10條染色體上有91個BraNAC家族基因發生了87對片段復制。表明BraNAC基因在進化過程中發生了一定規模的復制事件，導致BraNAC家族成員迅速擴張。

A01～A10表示1號染色體～10號染色體。

2.5 BraNAC基因家族蛋白質保守結構域、順式作用元件和基因結構分析

為了明確BraNAC基因家族蛋白質的結構特點，分析了保守結構域，結果如圖4所示，不同亞家族含有不同的保守結構域數目和種類，并且保守結構域的序列長度各不相同。除第Ⅷ亞家族的成員含有6個保守結構域之外，其他各個亞家族結構域的數目都是4個，Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 5、Motif 7、Motif 8在亞家族Ⅰ～Ⅶ當中的數目較多，結構相對保守，表明這些結構域在BraNAC基因家族功能的發揮方面具有重要作用；而第Ⅷ亞家族保守結構域的數量增多，種類與其他各個亞家族不同。分析白菜型冬油菜上游1 500 bp啟動子序列，如圖4所示，大多數BraNAC家族成員上游主要有LTR、MBS、WUN-motif、GCN4_motif、CAAT-box、G-box、ABRE、TGA-element、GARE-motif等順式作用元件，各個啟動子的具體特征見表3。通過對BraNAC家族基因的結構分析(圖4)發現，不同亞家族外顯子和內含子數量存在差異，同一組內的數目相近。BraNAC036沒有內含子，其他成員含有2～6個，亞家族Ⅰ和Ⅷ的內含子長度相比于其他亞家族明顯增加，猜測這2個亞家族某些生物學功能可能發生了變化；亞家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的外顯子數目都是3個，亞家族Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ外顯子有4～6個；亞家族Ⅷ外顯子平均數達到了8個，與基因的保守性結構域相吻合，表明亞家族Ⅷ的BraNAC成員在進化過程中可能發生了功能分化。

motif表示保守結構域； TGA-box表示順式作用元件；UTR、CDS表示基因結構；LTR、MBS、WUN-motif、GCN4_motif、CAAT-box、G-box、ABRE、TGA-element、GARE-motif見表3。

表3 白菜型冬油菜NAC基因家族順式作用元件

2.6 低溫脅迫下白菜型冬油菜BraNAC基因的表達分析

為了進一步了解白菜型冬油菜NAC家族基因在非生物脅迫下的表達模式，根據BraNAC基因在低溫脅迫下的表達，分析2個不同品種白菜型冬油菜BraNAC基因在生長錐中的表達。由圖5可知，在低溫脅迫下，不同品種和不同處理時長BraNAC基因的表達變化不同，BraNAC097、BraNAC073、BraNAC095、BraNAC001、BraNAC061、BraNAC014、BraNAC033、BraNAC005、BraNAC115、BraNAC058、BraNAC003在隴油7號和Lenox中上調表達，BraNAC034、BraNAC051、BraNAC052、BraNAC025、BraNAC057、BraNAC118下調表達；冷處理初期，在隴油7號中上調表達的BraNAC家族基因少于Lenox，隨著脅迫時間的增加，在隴油7號中上調表達的BraNAC家族基因明顯多于Lenox。表明大部分BraNAC基因可能通過上調表達使白菜型冬油菜適應低溫環境。

圖5 低溫脅迫下BraNAC家族成員在生長錐中的表達分析

2.7 BraNAC家族基因的表達分析

基于系統發育和BraNAC家族基因表達數據，選擇了11個白菜型冬油菜NAC基因，分析低溫和干旱脅迫下其在根和葉中的表達變化，對2種抗逆性不同的白菜型冬油菜分別進行低溫處理和干旱處理，利用實時熒光定量PCR來檢測BraNAC基因的表達水平。由圖6A可知，低溫脅迫下，白菜型冬油菜的根中大多數基因表達量在處理后24 h達到最大，如BraNAC012和BraNAC027在隴油7號處理24 h時表達水平明顯升高，而在Lenox中變化不明顯，BraNAC066表達量在隴油7號中變化不明顯，而在Lenox中表達上調。在低溫脅迫的葉中(圖6B), 大多數基因在Lenox中的表達水平明顯高于隴油7號，如BraNAC068在處理48 h后表達量明顯升高，且在Lenox中變化更明顯，BraNAC035在Lenox中處理24 h后具有很高表達量，BraNAC066和BraNAC015在Lenox中處理4 h后具有很高表達量，BraNAC034在處理48 h后表達水平明顯升高，而在隴油7號中表達下調；因此，BraNAC012、BraNAC027和BraNAC068可能在植物抗寒方面起到正調控作用，相反，BraNAC035、BraNAC015、BraNAC066和BraNAC034可能與植物抗寒性呈負調控關系。

a1、a2、 a3、a4、a5、a6、a7分別表示隴油7號的根部對照、隴油7號的根部低溫處理1 h、隴油7號的根部低溫處理4 h、隴油7號的根部低溫處理6 h、隴油7號的根部低溫處理12 h、隴油7號的根部低溫處理24 h、隴油7號的根部低溫處理48 h。b1、b2、 b3、b4、b5、b6、b7分別表示Lenox的根部對照、Lenox的根部低溫處理1 h、Lenox的根部低溫處理4 h、Lenox的根部低溫處理6 h、Lenox的根部低溫處理12 h、Lenox的根部低溫處理24 h、Lenox的根部低溫處理48 h。

由圖7A可以看出，在干旱脅迫下，白菜型冬油菜根中BraNAC034、BraNAC012、BraNAC027和BraNAC015的表達量在干旱處理4 h、6 h、24 h后在隴油7號中與對照相比明顯上調，但在Lenox中變化不明顯。圖7B顯示，BraNAC066的表達量在隴油7號干旱處理4 h明顯升高，BraNAC012的表達量在隴油7號干旱處理6 h、48 h明顯升高，在Lenox中變化不明顯；干旱處理6 h，BraNAC068在隴油7號中的表達明顯上調；干旱處理1 h后，BraNAC072的表達量在Lenox中明顯升高，在隴油7號中沒有明顯變化；其他BraNAC基因干旱處理后在2個白菜型冬油菜品種中表達變化不明顯。因此BraNAC012、BraNAC015、BraNAC068、BraNAC066、BraNAC027、BraNAC034可能在植物抗旱方面發揮正調控的功能，BraNAC072可能與植物抗旱性呈負相關關系。

a1、a2、 a3、a4、a5、a6、a7分別表示隴油7號的根部對照、隴油7號的根部干旱處理1 h、隴油7號的根部干旱處理4 h、隴油7號的根部干旱處理6 h、隴油7號的根部干旱處理12 h、隴油7號的根部干旱處理24 h、隴油7號的根部干旱處理48 h。b1、b2、 b3、b4、b5、b6、b7分別表示Lenox的根部對照、Lenox的根部干旱處理1 h、Lenox的根部干旱處理4 h、Lenox的根部干旱處理6 h、Lenox的根部干旱處理12 h、Lenox的根部干旱處理24 h、Lenox的根部干旱處理48 h。

3 討論

本研究利用白菜型冬油菜隴油7號基因組測序數據，經鑒定得到119個BraNAC家族成員，聚類為8個亞家族，保守結構域分析結果表明，第Ⅷ亞家族的保守結構域數量增多，種類與其他各個亞家族不同。基因結構分析結果顯示，亞家族Ⅰ～Ⅶ的外顯子數目都是3～6個，而亞家族Ⅷ外顯子平均數達到8個，與基因的保守性結構域數目增多相吻合，可能在功能上出現了分化。順式作用元件分析結果顯示，BraNAC基因含有與冷脅迫、干旱脅迫、機械損傷、胚胎發育和內源激素調控等相關的響應元件，與前人的研究結果[7]一致。亞細胞定位結果表明，BraNAC蛋白在細胞核、細胞質、葉綠體、線粒體中都有分布,與之前研究結果[24]相比，在細胞中分布較為廣泛，表明BraNAC基因在進化過程中可能發生了功能擴張事件。

低溫和干旱是限制植物生長發育的重要氣候因子[25-30]，大量研究結果表明，NAC轉錄因子家族在植物響應寒冷[31]和干旱[6]信號途徑中發揮作用。在干旱脅迫下，MlNAC12大量表達的轉基因擬南芥與野生型相比，氣孔孔徑減小,活性氧(ROS)和丙二醛(MAD)積累減少，同時超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶等幾種抗氧化酶的活性顯著增強[32]，增強了轉基因擬南芥對干旱的耐受性。前人研究結果表明，當對白菜型冬油菜進行干旱脅迫時，CAT、SOD、POD活性與抗旱性呈正相關[33]，且不同抗旱品種的CAT、SOD、POD活性變化不一樣，在抗旱性弱的品種中各酶活性一般在相對較短的時間內變化較快。本研究利用2個抗性不同的白菜型冬油菜品種，篩選抗逆基因，結果發現，BraNAC012、BraNAC015、BraNAC068、BraNAC066、BraNAC027、BraNAC034都在隴油7號中干旱處理4 h后或者更長的時間后明顯大量表達，這些基因可能在Lenox中處理很短的時間內大量表達，增強了白菜型冬油菜CAT、SOD和POD的活性，同時，降低ROS的含量，表現為植株對干旱的適應。低溫通過影響植物體內的酶活性，減緩生理代謝過程，使細胞膜內外的滲透勢發生改變[31]，降低植物生長速率，從而造成生長緩慢，嚴重者可導致幼苗生長纖弱遲緩，葉片萎蔫、黃化，果實畸形等，最后導致農作物產量下降。在低溫脅迫下，植物細胞會通過提高相關酶的活性或產生滲透調節物質來適應不利的環境[34]。在辣椒中，NAC家族基因CaNAC064的大量表達顯著降低植株丙二醛(MDA)含量，增加滲透調節物質(Pro)含量，提高抗氧化酶活性，從而降低對低溫脅迫的敏感性[35]。本研究中，BraNAC012、BraNAC027在超強抗寒材料隴油7號低溫處理后表達量明顯升高，而在弱抗寒材料Lenox中變化不明顯。因此，BraNAC012、BraNAC027可能在提高白菜型冬油菜響應低溫脅迫相關蛋白質含量和滲透調節物質含量等方面發揮著重要作用。

本研究首次對白菜型冬油菜NAC家族進行全基因組鑒定和結構分析，發現了119個BraNAC家族成員，并預測了11個可能參與寒冷、干旱脅迫的候選基因。結果表明，BraNAC012、BraNAC015、BraNAC068、BraNAC066、BraNAC027、BraNAC034可以作為候選基因，提高作物抗旱性，BraNAC027和BraNAC012可以作為提高作物抗寒性的候選基因。同時，BraNAC家族基因受不同逆境脅迫誘導，并且存在組織與時間表達特異性。本研究結果為今后全面解析白菜型冬油菜NAC基因的功能提供參考。