熱應激通過鈣信號調控湖羊卵巢顆粒細胞凋亡和雌激素合成

李 樊， 李隱俠， 舒嘉傲， 孟春花， 張 俊， 錢 勇， 曹少先

(1.江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇南京210014；2.江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，江蘇南京210014；3.農業農村部種養結合重點實驗室，江蘇南京210014)

隨著綿羊養殖集約化發展和全球變暖加劇，熱應激對綿羊生產性能的不利影響日益嚴重。有研究結果表明，熱應激組公羔羊的生長速度和飼料利用率均顯著低于正常組的羔羊[1]；夏季公羔羊的生長速度、飼料利用率和腰肉產量均顯著低于冬季[2]。在交配周期內，環境溫度大于等于32 ℃的條件下每增加1 d，母羊的受精率和產羔率分別下降2.7%和3.5%[3-4]，說明交配期間的高溫對受精、胚胎存活都產生不利影響。熱應激影響綿羊卵母細胞后期的發育，且延長發情周期，導致受精率和胚胎成活率明顯下降。

鈣離子通過在細胞內外形成離子梯度，在細胞內充當第二信使。鈣穩態是細胞信號轉導的中心，受到許多離子通道、泵和交換器的嚴格調控[5]。在非興奮性細胞中，大多數細胞內鈣離子的釋放是通過以下3種通道進行的：(1)內質網膜上的1,4,5-三磷酸肌醇受體(IP3Rs)的鈣離子通道；(2)內質網中的RYR(Ryanodine)受體的鈣釋放通道；(3)溶酶體樣細胞器中的煙酸腺嘌呤二核苷酸(NAADP)鈣離子通道[6]。

控制鈣離子釋放或者積累的鈣信號通路在調控細胞周期、生長、發育和繁殖等方面發揮重要作用。鈣離子濃度在細胞分裂間期(DNA合成前期/DNA復制期、DNA合成后期/細胞分裂期)和細胞分裂中期到后期的相變期間顯著增加[7-9]。在斑馬魚和非洲爪蟾胚胎發育過程中都有觀察到細胞間的鈣波存在[10-11]，在哺乳動物卵子激活和胚胎發育中也發現了鈣信號的重要作用[12]。

本研究擬以湖羊卵巢顆粒細胞為對象，研究熱應激對細胞鈣離子濃度、鈣離子通路相關基因表達、細胞凋亡和雌激素合成的影響，以期為解析熱應激影響綿羊繁殖性能的分子機制提供理論依據，為緩解夏季綿羊熱應激提供候選靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮的湖羊卵巢從江蘇省太倉市東林屠宰場采集，放入裝有37 ℃生理鹽水的保溫杯中立即帶回實驗室。生理鹽水沖洗3遍后用手術剪剪掉卵巢周圍組織，注射器抽取3～5 mm卵泡的卵泡液后輕輕注入15 ml的離心管中，1 000 r/min離心5 min，再用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)清洗2遍后棄去PBS；用預熱的DMEM/F-12培養基重懸細胞并將細胞接種于細胞培養6孔板中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中；24 h后觀察細胞貼壁情況，用PBS清洗細胞，更換培養基，進行后續試驗。

1.2 試驗處理

湖羊卵巢顆粒細胞培養24 h，貼壁后分為3組，對照組(37 ℃)、熱應激組(42 ℃)和熱應激+鈣離子螯合劑(BAPTA-AM)組(42 ℃)，分別在5% CO2細胞培養箱中培養4 h后收集細胞，進行RNA和蛋白質提取，每項試驗進行3個生物學重復。

1.3 RNA提取和逆轉錄

用RNA提取試劑盒(BioTeke公司產品)抽提RNA，Nandrop2000分光光度計[賽默飛世爾科技(中國)有限公司產品]測定RNA質量濃度。采用逆轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品)將RNA逆轉錄為cDNA；20 μl反應體系為：RNA 1 000 ng，4×gDNA wiper Mix 4 μl，RNase Free dH2O 16 μl，混合均勻，42 ℃ 2 min去除基因組DNA，然后加入5×HiScript II qRT SuperMix II 4 μl，吹打混勻， 50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反轉錄后所得的cDNA產物可于-20 ℃或-80 ℃保存備用。

1.4 引物合成和real-time PCR

根據綿羊相關基因的NCBI序列，采用Primer 5.0軟件設計特異性引物，以β-actin為內參基因，進行real-time PCR試驗(表1)。20.0 μl反應體系：2.0 μl cDNA，10.0 μl 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix (南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品)，0.4 μl上游引物，0.4 μl下游引物，7.2 μl ddH2O。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環；最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每個樣本重復3次。

表1 real-time PCR引物序列

1.5 Western blot分析

將卵巢顆粒細胞接種于6孔板中，待細胞密度達到80%時，將培養板分別置于37 ℃、42 ℃和42 ℃+BAPTA-AM條件下培養4 h，收集細胞蛋白質樣品，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白質質量濃度，100 ℃ 10 min變性。處理好的蛋白質樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，上樣量為30 μg，60 V電泳3.0 h，然后進行轉膜(100 V，30 min)，將膜置于5%脫脂牛奶中封閉1.5 h，用GAPDH蛋白(Proteintech公司產品，貨號 60004-1-lg，稀釋倍數1∶3 000)、BAX蛋白(Proteintech公司產品，貨號 50599-2-lg，稀釋倍數1∶2 000)、BCL2蛋白(Proteintech公司產品，貨號 66799-1-lg，稀釋倍數1∶2 000)、MFN2蛋白(AFFINITY公司產品，貨號 DF8106，稀釋倍數1∶2 000)、FIS1蛋白(AFFINITY公司產品，貨號 DF12005，稀釋倍數1∶1 000)、CYP19A1蛋白(AFFINITY公司產品，貨號 DF6884，稀釋倍數1∶1 000)抗體4 ℃敷育過夜，含吐溫20的Tris鹽酸(TBST)緩沖液洗膜(1次10 min，3次)，二抗室溫敷育2 h，洗膜，顯影，image J灰度值分析。

1.6 鈣離子濃度測定方法

去除顆粒細胞的培養液，用Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)緩沖液清洗3遍，每孔加入200 μl Fluo-4 AM(Fluo-4是鈣離子熒光探針，AM是一種乙酰甲酯衍生物)工作液(終濃度為1 μmol/L)，37 ℃孵育30 min，隨后用HBSS洗滌3次，洗滌后再孵育30 min以確保Fluo-4 AM在細胞內完全轉變成Fluo-4。熒光顯微鏡檢測熒光并拍照分析，以確定細胞內鈣離子濃度的變化。

1.7 流式細胞術檢測卵巢顆粒細胞的細胞凋亡率

湖羊卵巢顆粒細胞在各處理下培養48 h后，胰酶[不含乙二胺四乙酸(EDTA)]消化5 min，冷PBS緩沖液清洗2次， 100 μl 1×binding buffer 重懸，加入5 μl FITC Annexin V 和5 μl PI染色液混勻，避光孵15 min，加400 μl 1×binding buffer混勻, 染色后的樣品于1 h內在流式細胞儀中進行細胞凋亡水平的檢測，結果用FlowJo V7.6 軟件進行分析。

1.8 數據分析

采用SPSS16.0 軟件中t檢驗以及單因素方差分析進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 熱應激對湖羊卵巢顆粒細胞鈣離子濃度的影響

利用Fluo-4鈣離子熒光探針檢測熱應激前后湖羊卵巢顆粒細胞中鈣離子濃度的變化。結果(圖1)顯示，與對照組相比，熱應激組湖羊卵巢顆粒細胞的鈣離子熒光強度明顯增強，說明熱應激誘導卵巢顆粒細胞鈣離子濃度升高。加入BAPTA-AM后，熱應激組的鈣離子濃度明顯下調。

圖1 熱應激對湖羊卵巢顆粒細胞鈣離子濃度的影響

2.2 熱應激對湖羊卵巢顆粒細胞中鈣離子信號通路相關基因表達的影響

鈣離子是細胞的第二信使，熱應激導致卵巢顆粒細胞鈣離子濃度上升，可引起細胞膜的去極化。以鈣離子信號通路中細胞膜去極化通路中CACNA1C、CACNA1B、RYR1和CAMK2共4個基因為對象，real-time PCR檢測熱應激對這4個基因mRNA表達的影響。結果(圖2)表明，熱應激組湖羊卵巢顆粒細胞中鈣離子信號通路中CACNA1B、CACNA1C、RYR1、CAMK2基因表達均顯著或極顯著上調，但是熱應激+鈣離子螯合劑組，CAMK2基因表達顯著下調(P<0.05)。

*表示差異達0.05顯著水平；**表示差異達0.01顯著水平。

2.3 熱應激通過鈣信號調控湖羊卵巢顆粒細胞線粒體結構相關蛋白質表達

以線粒體融合蛋白2(MFN2)和分裂蛋白(FIS1)為對象，檢測熱應激后其在卵巢顆粒細胞中表達水平的變化。Real-time PCR(圖3)和Western blot結果(圖4)顯示，與對照組相比，熱應激組線粒體融合蛋白基因MFN2無論是mRNA表達水平還是蛋白質表達水平均無顯著變化，但是熱應激組線粒體分裂蛋白基因FIS1的mRNA、蛋白質表達水平均顯著提高。熱應激+鈣離子螯合劑組，FIS1基因的mRNA、蛋白質表達水平均較熱應激組顯著下調。

*表示差異達0.05顯著水平；**表示差異達0.01顯著水平。

*表示差異達0.05顯著水平；**表示差異達0.01顯著水平。

2.4 熱應激通過鈣信號調控湖羊卵巢顆粒細胞凋亡

流式細胞儀檢測結果(圖5)顯示，與對照組相比，熱應激組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，熱應激+鈣離子螯合劑組細胞凋亡率下降。與對照組相比，熱應激組促凋亡蛋白家族代表基因BAX和抗凋亡蛋白家族代表基因BCL2在卵巢顆粒細胞中mRNA表達量的比值(BAX/BCL2)顯著上升，但是加入鈣離子螯合劑后比值下降。Western blot結果表明，熱應激組BAX蛋白表達量上升，BCL2蛋白表達量下降，加入鈣離子螯合劑后結果相反。說明熱應激通過鈣離子信號調控BAX基因表達上調和BCL2基因表達下調，調控湖羊卵巢顆粒細胞的凋亡。

A～C：流式細胞儀檢測對照組(37 ℃)、熱應激組(42 ℃)、熱應激+鈣離子螯合劑組湖羊卵巢顆粒細胞凋亡情況；D：流式細胞儀檢測不同處理卵巢顆粒細胞凋亡率；E～F：熱應激對顆粒細胞BCL2、BAX蛋白表達水平的影響；G：熱應激對顆粒細胞促凋亡蛋白家族代表基因BAX和抗凋亡蛋白代表基因BCL2 mRNA表達量比值(BAX/BCL2)的影響。*表示差異達0.05顯著水平。Annexin V：鈣離子依賴性磷脂結合蛋白。

2.5 熱應激通過鈣信號調控湖羊卵巢顆粒細胞功能

為了研究熱應激對湖羊卵巢顆粒細胞功能的影響，本研究用ELISA方法檢測熱應激后卵巢顆粒細胞雌二醇的水平。圖6顯示，與對照組相比，熱應激組雌二醇含量顯著下降(P<0.05)；熱應激+鈣離子螯合劑組與熱應激組相比，雌二醇含量顯著上升(P<0.05)。與對照組相比，雌激素合成關鍵基因CYP19A1的mRNA表達水平和蛋白質表達水平在熱應激組卵巢顆粒細胞中均顯著下降(P<0.05)，但是熱應激+鈣離子螯合劑組與熱應激組相比顯著上升(P<0.05)。說明熱應激通過鈣離子濃度調控湖羊卵巢顆粒細胞雌二醇合成能力，影響卵巢顆粒細胞的功能。

A～B：熱應激對卵巢顆粒細胞CYP19A1 mRNA、蛋白質表達水平的影響；C：熱應激對卵巢顆粒細胞雌二醇水平的影響;*表示差異達0.05顯著水平。

3 討論

熱應激對動物健康有重要影響，可顯著降低生產力和繁殖性能[13-14]。大量研究結果表明，很多基因和信號通路參與了熱應激調控動物生產性能的過程，鈣信號通路就是其中之一[15-17]。有研究發現，Ca2+-CaMK2-HSF1信號通路調控斑馬魚的熱應激[17]。本研究以湖羊卵巢顆粒細胞為對象，發現熱應激處理后，卵巢顆粒細胞中鈣離子濃度顯著上升，說明熱應激導致卵巢顆粒細胞鈣離子濃度發生變化，破壞細胞內的鈣平衡。

熱應激是如何調控卵巢顆粒細胞鈣離子濃度變化的呢？鈣離子通過其進入通道和釋放通道進出細胞膜和細胞器，以滿足機體各項生理功能的需要[5]。電壓門控鈣離子通道是一種鈣進入通道，鑲嵌于細胞膜上，其中央是高度選擇性的親水通道，允許適當電荷和適當大小的鈣離子通過[18]。本研究發現熱應激后電壓門控鈣離子通道基因CACNA1C、CACNA1B的mRNA表達水平顯著上升，說明熱應激打開了細胞膜上的鈣進入通道。RYR1是內質網鈣離子釋放通道的一個關鍵受體[19]，是內質網鈣池的鈣離子進入細胞漿的重要通道之一。熱應激后湖羊卵巢顆粒細胞中RYR1表達量顯著上升，說明熱應激引起卵巢顆粒細胞中內質網應激，內質網中的鈣離子通過RYR1受體進入細胞質。總之，熱應激打開卵巢顆粒細胞鈣離子進入通道和釋放通道，導致細胞外鈣離子進入細胞質，內質網中的鈣離子釋放到細胞質，導致細胞質內鈣離子濃度上調。

釋放到細胞質中的Ca2+很快與Ca2+結合蛋白相結合，成為信號轉導途徑的激活成分，鈣調素就是其中之一。鈣調蛋白是一種依賴于鈣離子活性的蛋白質，與鈣離子結合形成Ca2+/CaM復合物，從而啟動下游多種信號通路[20]。熱應激導致卵巢顆粒細胞鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶(CAMK2)表達量顯著升高，但是在熱應激卵巢顆粒細胞中加入鈣離子螯合劑后，CAMK2基因表達量顯著下調，說明熱應激導致卵巢顆粒細胞鈣離子濃度上升，誘導CAMK2表達上調，進而啟動下游其他信號通路，參與調控細胞的功能。

線粒體為細胞正常生長代謝提供必需的能量，線粒體穩態對維持機體的生物學功能具有非常重要的作用[21-23]。融合和分裂伴隨著線粒體的一生，維持著線粒體的穩態[24]。有研究發現，氧化應激會損傷線粒體，破壞線粒體穩態[25]。本研究選擇調控線粒體融合和分裂的2種蛋白質MFN2、FIS1，探討熱應激導致鈣離子濃度變化后對MFN2、FIS1表達的影響。結果發現在湖羊卵巢顆粒細胞中，熱應激導致線粒體分裂基因FIS1表達量顯著升高，降低細胞內鈣離子濃度后FIS1基因表達水平恢復正常，說明熱應激可能通過調控鈣離子濃度來調控線粒體分裂基因FIS1的變化，進而誘導線粒體損傷。

BAX作為促凋亡蛋白參與細胞凋亡，而BCL2蛋白可拮抗BAX的促凋亡效應，BAX/BCL2失衡導致半胱天冬酶釋放并引發半胱天冬酶級聯發生，最終激活半胱天冬酶3導致細胞凋亡[26-27]。本研究發現，熱應激后綿羊卵巢顆粒細胞的細胞凋亡率顯著上升，促凋亡蛋白基因BAX和抗凋亡蛋白基因BCL2的表達量比值顯著上升；加入鈣離子螯合劑后，BAX/BCL2表達量比值顯著下降，細胞凋亡率下降，表明熱應激通過調控鈣離子濃度的變化，引起BAX/BCL2表達量比值變化，進而誘導卵巢顆粒細胞凋亡。

卵巢顆粒細胞是雌性動物卵巢卵泡的重要組成部分，顆粒細胞分泌雌二醇，促進卵泡的生長發育和卵母細胞的成熟，進而調控雌雄動物的生殖[28]。本研究發現，熱應激后調控雌激素合成關鍵基因CYP19A1的mRNA、蛋白質表達水平均顯著下降，但是加入鈣離子螯合劑后CYP19A1的mRNA、蛋白質表達水平顯著上升；相應的，熱應激后湖羊卵泡顆粒細胞分泌雌二醇的能力顯著下降，鈣離子螯合劑加入后能恢復由于熱應激導致的雌二醇下降。說明熱應激通過鈣離子信號調控卵巢顆粒細胞凋亡，從而影響其細胞功能，進而影響動物的繁殖。

4 結論

熱應激導致卵巢顆粒細胞細胞膜上的鈣離子進入通道(電壓門控鈣離子通道)和鈣離子釋放通道(RYR1受體)打開，鈣離子濃度上升，導致CAMK2蛋白表達上調，激活下游信號通路，誘導細胞凋亡，進而影響卵巢顆粒細胞的功能，調控綿羊的繁殖性能。