不同鄰苯二甲酸二丁酯污染方式對其降解和土壤細菌群落的影響

程金金， 孫 星， 田莉莉， 王 亞， 余向陽

(1.江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所，江蘇南京210014；2.省部共建國家重點實驗室培育基地/江蘇省食品質量安全重點實驗室，江蘇南京210014)

鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)是一種常見的鄰苯二甲酸酯類化合物，主要用作增塑劑、染料溶劑、橡膠助劑等。近年來，由于大氣沉降、污水灌溉、污泥農用以及肥料、農藥和農膜的大量使用，DBP已成為中國農田土壤中較易被檢出且含量較高的鄰苯二甲酸酯類污染物之一[1]。農田土壤中高含量的DBP不僅會影響作物生長和農產品品質[2]，還會通過食物鏈危害人體健康，導致人體內分泌紊亂、生殖機能失常等[3]。美國國家環保局已將DBP列為優先控制的污染物和內分泌干擾物，中國也將其列為優先控制的污染物。

土壤微生物作為指示土壤污染的敏感受體，對DBP污染具有靈敏的響應[4]。已有研究發現，DBP污染對土壤微生物群落結構、多樣性及碳、氮、硫循環等生態功能均會產生影響[5-6]。此外，DBP污染對土壤DBP降解菌群、DBP降解基因豐度也有較大影響。Xu等[7]研究發現，DBP污染增加了土壤中DBP降解基因的豐度。吳學玲等[8]研究發現，DBP污染對土壤中能夠耐受和利用DBP的細菌類群起到了選擇性富集的作用。微生物降解作用是土壤中DBP消減的主要途徑[9]。因此，DBP降解菌群及降解基因豐度的變化可能對后續土壤中DBP污染的降解產生影響，相關研究有待深入。

目前，關于DBP對土壤微生物影響的研究多采用高劑量單次污染的方法。實際上，DBP主要是在大氣沉降、地膜使用等過程中以低劑量逐步累積的方式進入土壤環境中[10]。在高劑量單次污染處理下，由于污染物未充分老化，因而其生物有效性較高[11]。多項研究均發現，有機污染物高劑量單次污染處理與低劑量累積污染處理間的環境風險和生態毒性差異顯著[12-13]，采用高劑量單次污染的處理方式可能會高估有機污染物的實際環境風險和生態毒性[14-15]。因此，采用高劑量DBP單次污染處理與低劑量DBP累積污染處理對土壤微生物群落結構及功能的影響可能存在較大差別。目前，關于不同污染方式下DBP對土壤微生物及相關功能影響的報道較少。

因此，本研究選擇2種物理化學性質和生物學性質差異較大的土壤作為供試土壤，模擬高劑量DBP單次污染和低劑量DBP累積污染的方式，對比研究不同污染方式對DBP降解能力的影響及不同污染方式的DBP對土壤微生物群落結構、多樣性的影響，以期為準確評估受DBP污染土壤的環境效應提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試的2種土壤分別為采自江蘇省南京市農田的0～20 cm層黃棕壤(地理位置：32°01′58″N，118°52′15″E)和廣西壯族自治區南寧市農田的0～20 cm層紅壤(地理位置：23°08′05″N，109°01′07″E)。供試黃棕壤、紅壤的pH值分別為7.24、4.38，有機碳含量分別為7.44 g/kg、6.44 g/kg，黏粒含量分別為27%、65%，微生物量碳含量分別為165 mg/kg、43 mg/kg。供試的2種土壤除基本理化性質、生物學性質差異較大外，對DBP降解能力的差異也較大。DBP在供試黃棕壤、紅壤中的降解半衰期分別為0.65 d、2.53 d。將土樣帶回實驗室后立即去除植物根系等雜物，過2 mm不銹鋼篩網后放置于4 ℃冷庫中備用。為保證土壤微生物的活性，在試驗開始前，將土壤含水量調節至50%田間最大持水量，于25 ℃人工氣候箱中預培養7 d。

1.2 試驗處理

根據相關報道提到的中國農田土壤中DBP污染的濃度范圍[16]，試驗設高劑量(20 mg/kg)DBP單次污染處理(S處理)、低劑量(每次1 mg/kg) DBP累積污染處理(每周污染1次，連續污染20次，R處理)和對照(CK，無DBP污染)，重復3次。首先按如下方法分別制備DBP含量為0 mg/kg、100 mg/kg、2 000 mg/kg的污染母土：在通風櫥中，將DBP(分析純，含量為99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶于丙酮后按預設含量加入到一定量供試土壤中并混合均勻，待丙酮完全揮發后研磨土壤并將其粉碎過60目篩。試驗開始時，按質量比1∶99取污染母土和預培養土壤于玻璃燒杯中，在試驗第1～19周，繼續向玻璃燒杯中加入1%(質量比)污染母土，充分混合均勻后，調節含水量至田間最大持水量的50%，用透氣膜封口，于25 ℃人工氣候箱中恒溫培養，每3 d稱1次質量并補充損失的水分。在2種污染方式下，總DBP污染物含量均為20 mg/kg。不同處理下DBP的添加量及總DBP污染物含量詳見表1。

表1 不同污染方式的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)添加量和總污染物含量

1.3 樣品的采集及測定

從第20周起，每周采樣并測定不同處理組的DBP含量。當不同處理組的DBP含量均低于1 mg/kg時(試驗第23周末)，采集玻璃燒杯中的土壤樣品，用于土壤微生物群落多樣性和DBP降解能力的測定。

土壤細菌群落多樣性的測定。用HiPure Soil DNA Kits(Magen，China)提取土壤中的總DNA。確認土壤總DNA純度、濃度和完整性后，以土壤總DNA為模板，用細菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌的16S rRNA進行PCR擴增。用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen，USA)、Quantus熒光定量系統(Promega，USA)對PCR擴增產物進行純化回收和檢測定量。用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序，測序數據分析基于上海美吉生物醫藥科技有限公司的云平臺(https://cloud.majorbio.com/)。

土壤DBP降解能力的測定：取一部分S處理、R處理和CK的土壤樣品進行滅菌處理。分別取200 g S處理、R處理、CK、S滅菌處理、R滅菌處理和CK滅菌處理的土壤樣品，向其中加入2 g 2 000 mg/kg DBP污染母土，使土壤樣品中后續加入的DBP含量為20 mg/kg。充分混合均勻后，調節土壤含水量至田間最大持水量的50%，用透氣膜封口后于25 ℃恒溫培養箱中避光培養。在培養的第0、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h采集土壤樣品，測定土壤中殘留的DBP量。土壤中殘留的DBP的提取和測定參照Cheng等[17]的方法，回收率為82.5%～106.1%，滿足微量分析的要求。用OriginPro 2015軟件擬合土壤中殘留DBP的動態曲線：Ct=C0e-kt，式中，Ct(mg/kg)為t(h)時土壤中的DBP殘留量，C0(mg/kg)為土壤中初始的DBP含量，k(d-1)為降解速率常數，e為數學常數。DBP降解半衰期采用公式t1/2=ln2/k進行計算。

2 結果與分析

2.1 不同DBP污染方式對土壤細菌群落α多樣性的影響

對不同DBP污染方式下的土壤細菌群落進行α多樣性分析。由表2可以看出，在黃棕壤中，細菌群落多樣性指數(Shannon指數、Simpson指數)、豐富度指數(Ace指數、Chao指數)和均勻度指數(Heip指數、Smith-Wilson指數)在不同DBP污染方式下與對照間均無顯著差異，表明高劑量DBP單次污染處理、低劑量DBP累積污染處理對黃棕壤微生物群落多樣性的影響較小。在不同DBP污染方式下，紅壤的細菌群落多樣性指數、均勻度指數與對照間均無顯著差異，而在高劑量DBP單次污染處理下，細菌群落的豐富度指數較對照顯著降低(P<0.05)。由此可見，高劑量DBP單次污染處理對紅壤細菌群落的豐富度有顯著影響，而低劑量DBP累積污染處理對紅壤細菌多樣性、豐富度、均勻度均無顯著影響。總體上看，土壤細菌多樣性對不同DBP污染方式的響應較不敏感。

表2 不同鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)污染方式下土壤細菌群落的α多樣性

2.2 不同DBP污染方式對土壤細菌群落β多樣性的影響

在屬分類水平上對不同DBP污染方式處理組的土壤細菌群落β多樣性進行主坐標分析(PCoA)。由圖1可以看出，紅壤中PC1、PC2的貢獻率分別為80.59%、7.71%，二者的累積貢獻率為88.30%；黃棕壤中PC1、PC2的貢獻率分別為44.44%、17.31%，二者的累積貢獻率為61.75%。由此可見，PC1、PC2這2個主成分可以解釋紅壤、黃棕壤細菌群落組成的主要變異度。在不同污染方式處理下，土壤細菌群落在PC1、PC2組成的二維平面上可以明顯分開，表明不同DBP污染方式對紅壤、黃棕壤細菌群落有明顯影響。

CK：對照；S：高劑量DBP單次污染處理；R：低劑量DBP累積污染處理。

為了進一步檢驗不同DBP污染方式處理下土壤細菌群落間的差異顯著性，在屬分類水平上對不同DBP污染方式處理組的土壤細菌群落結構進行組間相似性分析(Analysis of similarities, Anosim)，結果表明，黃棕壤、紅壤中細菌群落結構的組間差異(R值)為0.49～1.00(表3)。R值越接近1.00表示組間差異越大。與對照相比，不同DBP污染方式對黃棕壤、紅壤中細菌群落結構均產生了較為明顯的影響。其中，黃棕壤中低劑量DBP累積污染處理組與對照組之間的R值(0.74)高于高劑量DBP單次污染處理組與對照組之間的R值(0.56)，表明低劑量DBP累積污染處理對黃棕壤細菌群落結構組成的影響大于高劑量DBP單次污染處理。紅壤中高劑量DBP單次污染處理組與對照組之間的R值(1.00)大于低劑量DBP累積污染處理組與對照組之間的R值(0.49)，表明高劑量DBP單次污染處理對紅壤細菌群落結構組成的影響大于低劑量DBP累積污染處理。紅壤中高劑量DBP單次污染處理組與對照之間的R值顯著大于黃棕壤中的相應R值，表明高劑量DBP單次污染處理對紅壤細菌群落結構組成的影響大于黃棕壤。

表3 不同鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)污染方式下土壤細菌群落結構的組間差異

進一步通過組間的差異顯著性檢驗，篩選出不同處理間群落相對豐度均存在顯著差異(P<0.05)的優勢菌屬。由圖2可以看出，與對照相比，黃棕壤中2種DBP污染方式均明顯降低了赭黃嗜鹽囊菌屬、硝化螺菌屬、不動桿菌屬、Parasegetibacter屬和Nordella屬細菌群落的相對豐度，均明顯提高了土壤紅桿菌屬、Iamia屬和Conexibacter屬細菌群落的相對豐度。與對照和高劑量DBP單次污染處理相比，低劑量DBP累積污染處理明顯提高了類諾卡氏菌屬、氣微菌屬、土壤紅桿菌屬、Iamia屬和Conexibacter屬細菌群落的相對豐度。與對照和低劑量DBP累積污染處理相比，高劑量DBP單次污染處理明顯降低了類諾卡氏菌屬、氣微菌屬細菌的相對豐度。

CK：對照；S：高劑量DBP單次污染處理；R：低劑量DBP累積污染處理。*表示與CK間差異顯著(0.01

由圖3可以看出，與對照相比，低劑量DBP累積污染處理明顯提高了紅壤中慢生根瘤菌屬、Amycolatopsis屬細菌的相對豐度，高劑量DBP單次污染處理明顯提高了紅壤中慢生根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬細菌的相對豐度，明顯降低了兩面神菌屬、馬杜拉放線菌屬、Ramlibacter、Conexibacter、Marmoricola、Actinospica和Kutzneria屬細菌的相對豐度。在低劑量DBP累積污染處理中，紅壤中兩面神菌屬、馬杜拉放線菌屬、Ramlibacter、Amycolatopsis、Marmoricola、Actinospica和Kutzneria屬細菌的相對豐度明顯高于高劑量DBP單次污染處理，慢生根瘤菌屬、鞘氨醇單胞菌屬細菌的相對豐度明顯低于高劑量DBP單次污染處理。

CK：對照；S：高劑量DBP單次污染；R：低劑量DBP累積污染。*表示與CK間差異顯著(0.01

2.3 不同DBP污染方式處理后土壤中DBP殘留情況

用不同DBP污染方式處理161 d后，高劑量單次污染處理下的紅壤、黃棕壤中DBP殘留量分別為0.36 mg/kg、0.42 mg/kg，低劑量累積污染處理下的紅壤、黃棕壤中DBP殘留量分別為0.21 mg/kg、0.33 mg/kg。說明在不同DBP污染方式處理過程中，低劑量(每次1 mg/kg)累積污染方式更有利于DBP的降解。

2.4 不同DBP污染方式處理后的土壤降解DBP的能力

如圖4所示，隨著培養時間的延長，滅菌土壤中的DBP含量均略有降低，而在未滅菌土壤中均大幅降低，表明土壤中的微生物在DBP降解中起主導作用。由圖4還可以看出，不同污染方式明顯影響了后續進入土壤中DBP的降解。與對照相比，培養72 h后，紅壤中低劑量DBP累積污染處理、高劑量DBP單次污染處理的DBP殘留量分別減少了72.65%、34.00%，黃棕壤中低劑量DBP累積污染處理、高劑量DBP單次污染處理的DBP殘留量分別減少了41.22%、36.08%。在紅壤中，2種污染方式間土壤中的DBP的殘留量在培養12～72 h均有較大差異，而在黃棕壤中，僅在培養12 h時2種污染方式間土壤中DBP殘留量之間差異較明顯。從表4可以看出，與對照相比，低劑量DBP累積污染處理、高劑量DBP單次污染處理均明顯降低了DBP的降解半衰期，提高了土壤對后續DBP污染的降解能力。在黃棕壤中，高劑量DBP單次污染處理DBP的降解半衰期比對照組減少了46.15%，低劑量DBP累積污染處理的DBP降解半衰期比對照減少了61.54%。在紅壤中，高劑量DBP單次污染處理的DBP降解半衰期比對照減少了41.11%，低劑量DBP累積污染處理的DBP降解半衰期比對照減少了86.56%。與高劑量DBP單次污染處理相比，低劑量DBP累積污染處理的紅壤、黃棕壤對后續進入土壤中的DBP降解半衰期分別縮短了77.18%、28.57%，表明低劑量累積污染處理在提高土壤對DBP的降解能力上具有更強的作用。

CK：對照；S：高劑量DBP單次污染；R：低劑量DBP累積污染。

表4 不同污染方式處理后鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)在2種土壤中的降解半衰期

3 討論

與對照相比，低劑量DBP累積污染處理對紅壤、黃棕壤的微生物多樣性指數、均勻度指數和豐富度指數均無明顯影響，這可能與低劑量DBP進入土壤后能與土壤充分作用，并被土壤迅速吸附和降解有關[12,18]。高劑量DBP單次污染處理顯著降低了紅壤中細菌群落的豐富度指數，但對黃棕壤中細菌群落多樣性指數、豐富度指數和均勻度指數均無顯著影響。同時，高劑量DBP單次污染處理對紅壤中細菌群落結構組成的影響大于黃棕壤。有研究發現，土壤有機質含量越低，對DBP的吸附作用越弱，從而增強了DBP的生物有效性和生態毒性[17,19]。在本研究中，紅壤的有機質含量遠低于黃棕壤，因而紅壤中DBP的生物有效性和生態毒性更高，這可能是導致高劑量DBP單次污染對紅壤細菌群落豐富度指數、細菌群落結構組成影響較大的一個重要原因。此外，在微生物數量多、種類豐富的土壤中，土壤生態系統的抗逆性更強[20]。紅壤中微生物量碳、Shannon多樣性指數明顯低于黃棕壤，表明紅壤中的微生物數量更少，多樣性更低，對DBP污染脅迫的抵御能力更差，這可能是高劑量DBP單次污染對紅壤中微生物多樣性、細菌群落結構組成影響較大的又一個重要原因。

在土壤細菌豐度方面，與對照相比，2種污染處理均顯著改變了黃棕壤中硝化螺菌屬、紅壤中慢生根瘤菌屬細菌的相對豐度。硝化螺菌屬細菌是參與土壤硝化作用的關鍵微生物[21]，而土壤慢生根瘤菌屬細菌被認為是固氮過程中的關鍵菌，在氮素循環中起著重要作用[22]。因此可見，在本研究中的2種污染方式下，DBP均對土壤氮素循環功能產生了擾動，這與Wang等[6-7]的研究結果一致。此外，在高劑量DBP單次污染方式下，由于高含量DBP未經充分老化，黃棕壤中類諾卡氏菌屬、氣微菌屬細菌的相對豐度，以及紅壤中Ramlibacter、Marmoricola、Actinospica、Kutzneria等菌屬細菌的相對豐度較其他組明顯降低。據報道，上述幾類菌屬在土壤有機物分解、拮抗病原菌和促進植物生長等方面具有重要作用[23-28]。在低劑量DBP累積污染方式下，黃棕壤中類諾卡氏菌屬、氣微菌屬、土壤紅桿菌屬、Conexibacter等菌屬細菌以及紅壤中Amycolatopsis屬細菌的相對豐度較其他組明顯提高，這幾類菌屬與土壤有機物分解、拮抗病原菌等功能相關[23-24,29-31]。由此可見，在本研究的2種污染方式下，DBP對土壤中具有氮素循環、有機物分解、拮抗病原菌和植物促生等重要功能的細菌群落產生了明顯擾動，但土壤中承擔同一功能的微生物種類眾多[32]，受到測序技術的限制，本研究僅得到了部分功能菌群變化的信息，關于DBP對土壤相關菌群功能的影響還需進一步研究。

在土壤中DBP的降解方面，土壤微生物被認為在土壤中DBP的降解過程中起關鍵作用[33]。已有研究發現，DBP污染可造成DBP降解菌在土壤中富集以及土壤中DBP降解基因豐度的增加[7-8]，進而提高土壤對DBP污染的降解能力。在本研究中，與對照相比，2種污染方式提高了黃棕壤中土壤紅桿菌屬、Conexibacter屬細菌的相對豐度以及紅壤中鞘氨醇單胞菌屬細菌的相對豐度，它們均與有機污染物的降解密切相關[29-30,33]，這可能是2種污染處理明顯提高黃棕壤、紅壤對DBP污染降解能力的原因。對比2種污染方式可以發現，低劑量DBP累積污染處理對提高土壤DBP降解能力具有更強的作用。在低劑量DBP累積污染處理下，紅壤中的Amycolatopsis屬[31]細菌與黃棕壤中的類諾卡氏菌屬[23]、氣微菌屬[24]、土壤紅桿菌屬[29]細菌等與土壤有機污染物降解相關的菌屬細菌受到了誘導，群落的相對豐度較對照顯著增加。由此可見，低劑量DBP累積污染方式對土壤中DBP降解的促進作用更強，可能與DBP以低劑量累積的方式進入土壤，對土壤中具有DBP降解能力的微生物產生了較強的誘導作用有關[34]。

4 結論

土壤細菌群落α多樣性對不同DBP污染方式的響應較不敏感，僅高劑量DBP單次污染處理顯著降低紅壤細菌群落豐富度指數，其余處理的土壤細菌多樣性指數、豐富度指數和均勻度指數與對照相比均無顯著差異。土壤細菌群落β多樣性對不同DBP污染方式的響應敏感，紅壤細菌群落結構組成受高劑量DBP單次污染處理的影響較大，黃棕壤細菌群落結構組成受低劑量DBP累積污染處理的影響較大。2種DBP污染方式處理對紅壤、黃棕壤中部分具有氮素循環、有機物分解、拮抗病原菌和植物促生等重要功能的細菌群落產生了明顯擾動。本研究中的2種污染方式處理后明顯提高了紅壤、黃棕壤對DBP污染的降解能力。與高劑量DBP單次污染方式處理后的土壤相比，低劑量DBP累積污染方式處理后的土壤更大幅度地縮短了土壤中DBP降解半衰期。