江蘇蠶豆三葉草黃脈病毒的分子鑒定及全基因組結(jié)構(gòu)特征分析

高曉曉， 涂麗琴， 孫 楓， 李 碩， 崔曉艷， 陳 新， 章松柏， 季英華

(1.農(nóng)林病蟲(chóng)害預(yù)警與調(diào)控湖北省工程技術(shù)研究中心/長(zhǎng)江大學(xué)，湖北荊州434025；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇南京210014；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇南京210014)

蠶豆(ViciafabaL.)是豆科野碗豆屬的一個(gè)栽培種，屬于一年生或兩年生豆科植物。蠶豆是重要的冬季食用豆作物，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素、碳水化合物和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分；其用途廣泛，可用于食品加工和養(yǎng)殖業(yè)飼料生產(chǎn)，屬于重要的經(jīng)濟(jì)增收作物。中國(guó)蠶豆種植面積以及產(chǎn)量均位居世界首位[1]。但近年來(lái)在蠶豆生產(chǎn)過(guò)程中，病毒病發(fā)生種類(lèi)呈現(xiàn)多樣化態(tài)勢(shì)，同時(shí)其造成的危害也有加重趨勢(shì)，導(dǎo)致蠶豆產(chǎn)量減少和品質(zhì)下降[2]。目前報(bào)道的侵染蠶豆的病毒主要有三葉草黃脈病毒(Clover yellow vein virus, ClYVV)、蠶豆染色病毒(Broad bean stain virus, BBSV)、菜豆黃花葉病毒(Bean yellow mosaic virus, BYMV)及蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)等類(lèi)型[3]。病毒種類(lèi)的多樣化給蠶豆病毒病的高效防控提出了極大的挑戰(zhàn)。

三葉草黃脈病毒(Clover yellow vein virus, ClYVV)屬于馬鈴薯Y病毒科Y病毒屬成員，主要侵染菜豆[4]、豌豆、蠶豆和扁豆[5]等多種豆科植物及一些觀賞植物[6-7]。發(fā)病植株往往表現(xiàn)出頂部枯死、葉脈壞死和葉片脫落，同時(shí)豆莢變形壞死、發(fā)育遲緩[8]，嚴(yán)重時(shí)可引起植株全身扭曲變形并系統(tǒng)性壞死，極大地影響生產(chǎn)效益，給農(nóng)戶(hù)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失[9]。ClYVV最早由英國(guó)學(xué)者Hollings和Nariani從白三葉草中發(fā)現(xiàn)并分離[10]，之后西班牙[11]、美國(guó)[12]、澳大利亞[13]、韓國(guó)[14]等國(guó)的學(xué)者陸續(xù)地報(bào)道了該病毒對(duì)本國(guó)植物的危害。目前中國(guó)關(guān)于ClYVV的報(bào)道與研究相對(duì)較少。1989年，李長(zhǎng)松等[4]從山東泰安菜豆病樣中利用血清學(xué)方法檢測(cè)到三葉草黃脈病毒。張趁華等[15]開(kāi)展了侵染蠶豆ClYVV的鑒定與研究。

2018年，課題組在對(duì)江蘇省蠶豆病毒病調(diào)查過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)鹽城蠶豆上出現(xiàn)疑似ClYVV危害的癥狀。為進(jìn)一步確認(rèn)該病害的病原體隸屬的病毒種類(lèi)并明確其全基因組結(jié)構(gòu)特征，本研究擬利用分子手段對(duì)其進(jìn)行鑒定，并通過(guò)分段擴(kuò)增的方法獲得ClYVV江蘇蠶豆分離物全基因組序列，分析其基因組結(jié)構(gòu)特征，明確其分類(lèi)地位，為進(jìn)一步研究ClYVV的致病機(jī)制與制定防控策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

供試樣品為2018年采集于江蘇省鹽城市蠶豆樣品[16]，經(jīng)液氮冷凍后，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 試劑

RANiso Reagent、PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、PrimeSTARTMMAX、pMD18-T購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；TreliefTM5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京擎科生物公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.3 RNA提取

參照吳淑華等[17]的方法，利用Trizol法提取蠶豆樣品總RNA，提取后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR及ClYVV全基因克隆

以蠶豆疑似病樣總RNA為模板，參照涂麗琴等[16]的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。針對(duì)已報(bào)道的ClYVV全序列設(shè)計(jì)5對(duì)分段引物(表1)，以cDNA為模板，分別擴(kuò)增5段序列。PCR反應(yīng)總體系40 μl: PrimeSTAR MAX 20 μl, F、R引物各2 μl，ddH2O 14 μl, cDNA 2 μl。擴(kuò)增條件為94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，重復(fù)34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，12 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用Axygen試劑盒割膠回收后，連接至pMD18-T載體。利用熱激法轉(zhuǎn)化TreliefTM5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR檢測(cè)與酶切驗(yàn)證后將陽(yáng)性克隆送至安徽通用生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

表1 ClYVV基因片段擴(kuò)增引物

1.5 ClYVV全基因序列分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將獲得的5個(gè)片段序列進(jìn)行拼接，利用DNAstar、Snap Gene、BioEdit、Clustal X等軟件與NCBI上已公布的ClYVV 全基因序列進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)特征及多重序列比對(duì)分析，并利用BLAST網(wǎng)站進(jìn)行同源性分析。利用MEGA7軟件的鄰接法(Neighbor-joining Algorithm)進(jìn)行聚類(lèi)分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，進(jìn)化樹(shù)的可信度使用1 000次自導(dǎo)復(fù)制驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 病樣田間采集及ClYVV檢測(cè)

2018年，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鹽城部分田塊蠶豆植株葉片上卷皺縮、比較僵硬，同時(shí)會(huì)伴有壞死斑點(diǎn)，部分植株伴有褪綠等疑似病毒感染的癥狀(圖1)。田間疑似病樣采集后進(jìn)行分子檢測(cè)。在利用ClYVV特異性檢測(cè)引物(ClYVV-CP-F和ClYVV-CP-R，表1)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，發(fā)現(xiàn)從鹽城市采集的33份樣品中有19份能擴(kuò)增到特異的目的片段(圖1)。進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證后確認(rèn)檢測(cè)到的病毒為ClYVV，說(shuō)明當(dāng)?shù)匦Q豆上存在ClYVV的侵染危害。

A:健康蠶豆植株;B:發(fā)病蠶豆植株;C:鹽城蠶豆陽(yáng)性樣品ClYVV特異性擴(kuò)增圖譜。M:DL 5000 marker;CK:陰性對(duì)照;a～s:鹽城蠶豆陽(yáng)性樣品JS-1～JS-19。

2.2 ClYVV全基因組分段克隆

ClYVV基因組全長(zhǎng)約9～10 kb，本研究采用分段擴(kuò)增的策略(圖2)，設(shè)計(jì)5對(duì)針對(duì)ClYVV全基因序列的特異性引物(表1)，利用蠶豆病樣總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果5對(duì)引物均擴(kuò)增到與目的大小相同的條帶(圖3a)。回收目的條帶后，16 ℃連接pMD18-T載體，熱激法轉(zhuǎn)化TreliefTM5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆后，再經(jīng)酶切驗(yàn)證(圖3b)后送至安徽通用生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

圖2 ClYVV分段克隆策略

M：Marker DL 5000 marker; Cl1～Cl5: ClYVV5個(gè)基因片段。

2.3 ClYVV江蘇蠶豆分離物基因組特征分析

克隆片段序列測(cè)定后，基于重疊序列進(jìn)行拼接獲得完整ClYVV江蘇蠶豆分離物(ClYVV-JS)全基因序列，并發(fā)布于NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列登錄號(hào)為OP296252。ClYVV-JS基因組全長(zhǎng)9 585 bp，編碼區(qū)可分為P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、6K2、CI、VPg、NIa-Pro、NIb和CP(圖4)，編碼11個(gè)功能蛋白。基因組的1～191 bp為5′非編碼區(qū)，192～1 097 bp編碼302 aa組成的相對(duì)分子質(zhì)量約34 100的P1蛋白；1 098～2 468 bp編碼457 aa組成的相對(duì)分子質(zhì)量約52 200的HC-Pro蛋白；2 469～3 512 bp編碼348 aa組成的相對(duì)分子質(zhì)量約40 200的P3蛋白；2 469～3 160 bp+1bp編碼230 aa組成的相對(duì)分子質(zhì)量約26 000的P3N-PIPO蛋白，由P3的N段氨基酸和PIPO組成。3 513～3 671 bp編碼53 aa組成的相對(duì)分子質(zhì)量約5 900的6K1蛋白；3 672～5 576 bp編碼635 aa組成的相對(duì)分子質(zhì)量約71 400的CI蛋白；5 577～5 735 bp編碼53 aa組成的相對(duì)分子質(zhì)量約6 100的6K2蛋白；5 736～6 308 bp編碼191 aa組成的相對(duì)分子質(zhì)量約21 800的VPg蛋白；6 309～7 037 bp編碼243 aa組成的相對(duì)分子質(zhì)量約27 300的NIa-Pro蛋白；7 038～8 594 bp編碼519 aa組成的相對(duì)分子質(zhì)量約59 100的NIb蛋白；8 595～9 407 bp編碼271 aa組成的相對(duì)分子質(zhì)量約30 800的CP蛋白；9 408～9 585 bp為3′非編碼區(qū)。

圖4 ClYVV江蘇蠶豆分離物基因組結(jié)構(gòu)

2.4 ClYVV江蘇蠶豆分離物全基因組序列聚類(lèi)分析

根據(jù)ClYVV分段序列測(cè)序結(jié)果，拼接得到完整的ClYVV江蘇蠶豆分離物全基因序列。利用BLAST網(wǎng)站與NCBI上已報(bào)道的ClYVV全基因序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明ClYVV江蘇蠶豆分離物(ClYVV-JS)核苷酸序列與日本ClYVV No.30分離物(AB011819)同源性最高，達(dá)96.37%，與ClYVV安徽合肥分離物(KU922565)同源性為94.74%，而與馬鈴薯Y病毒屬同屬成員菜豆黃花葉病毒(Bean yellow mosaic virus, BYMV)、蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)、萵苣花葉病毒(Lettuce mosaic virus, LMV)、李痘病毒(Plum pox virus, PPV)、大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus, SMV)、西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)、韭蔥黃條病毒(Leek yellow stripe virus, LYSV)、豌豆種傳黃化病毒(Pea seed-borne mosaic virus, PSbMV)的同源性?xún)H達(dá)50%～70%(表2)。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示ClYVV-JS與ClYVV日本No.30分離物(AB011819)氨基酸序列同源性最高，達(dá)99.06%，與其他ClYVV分離物氨基酸序列同源性為93.07%～98.99%(表2)。經(jīng)Clustal W多重序列比對(duì)后，利用MEGA7軟件鄰接法進(jìn)行1 000次自導(dǎo)復(fù)制驗(yàn)證構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示ClYVV-JS與日本No.30分離物(AB011819)、韓國(guó)Dendrobium分離物(LC506604)、中國(guó)合肥分離物(KU922565)、韓國(guó)BH分離物(LC643587)、美國(guó)Ca分離物(MW287328)、日本90-1 Br2分離物(AB732962)、美國(guó)IA-2016分離物(MK292120)、日本I89-1分離物(LC096082)、韓國(guó)Gm分離物(KF975894)歸入一個(gè)分支，相對(duì)近緣，而與德國(guó)NGSTPS18分離物(MW848532)歸入不同分支，相對(duì)遠(yuǎn)緣，但它們都聚類(lèi)到ClYVV大分支中(圖5)。這些結(jié)果表明從江蘇蠶豆上分離到的病毒屬于三葉草黃脈病毒。

表2 系統(tǒng)進(jìn)化分析用到的病毒種類(lèi)及同源性分析

圖5 基于ClYVV全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 ClYVV江蘇蠶豆分離物基因序列分析

ClYYV全基因組序列聚類(lèi)分析的結(jié)果表明，ClYVV-JS與除德國(guó)NGSTPS18(MW848532)分離物外的9個(gè)分離物聚于一支，進(jìn)一步將ClYVV-JS基因組的11個(gè)基因序列與這9個(gè)分離物進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果(表3)顯示：P1的核苷酸序列與已報(bào)道的ClYVV分離物同源性為89.64%～96.91%，與日本No.30分離物(AB011819)同源性最高；HC-Pro的核苷酸序列同源性為93.95%～97.16%，與美國(guó)Ca分離物(MW287328)同源性最高；P3的核苷酸序列同源性為93.20%～96.84%，與美國(guó)IA-2016分離物(MK292120)同源性最高；P3N-PIPO的核苷酸序列同源性為92.63%～97.69%，與日本90-1 Br2分離物(AB732962)同源性最高；6K1的核苷酸序列同源性為89.31%～95.57%，與中國(guó)合肥ClYVV分離物(KU922565)同源性最高；CI的核苷酸序列同源性為91.08%～96.38%，與日本No.30分離物(AB011819)同源性最高；6K2的核苷酸序列同源性為90.57%～97.48%，與韓國(guó)BH分離物、美國(guó)IA-2016分離物(LC643587、MK292120)同源性最高；VPg的核苷酸序列同源性為96.51%～97.91%，與日本No.30分離物、日本90-1 Br2分離物(AB011819、AB732962)同源性最高；NIa-Pro的核苷酸序列同源性為96.71%～98.49%，與日本I89-1分離物(LC096082)同源性最高；NIb的核苷酸序列同源性為97.24%～98.46%，與日本No.30分離物(AB011819)同源性最高；CP核苷酸序列同源性為94.96%～97.41%，與日本No.30分離物(AB011819)同源性最高(表3)。這些結(jié)果說(shuō)明，在ClYVV的11個(gè)基因中，VPg、NIa-Pro和NIb這3個(gè)基因相較于其他基因變異相對(duì)較少，可能相對(duì)比較保守。

表3 ClYVV-JS與其他ClYVV分離物基因的同源性分析

3 討論

本研究對(duì)2018年江蘇省蠶豆病毒病調(diào)查過(guò)程中采集的蠶豆疑似病樣進(jìn)行病毒檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，鹽城局部蠶豆田塊存在ClYVV的侵染危害；進(jìn)而通過(guò)分段克隆獲得ClYVV-JS全基因組序列，明確了其基因組結(jié)構(gòu)特征。系統(tǒng)聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，該分離物屬于ClYVV的一個(gè)病毒株系，其與日本分離物(AB011819)[18]核苷酸序列同源性最高，達(dá)96.37%，氨基酸序列同源性達(dá)99.06%，而與中國(guó)安徽分離物(KU922565)[15]核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為94.74%和98.44%。雖然江蘇與安徽在地域上相對(duì)較近，但兩個(gè)分離物并未表現(xiàn)出最高的同源性，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明中國(guó)ClYVV的群體結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，江蘇的ClYVV侵染源可能不是臨近的安徽。

馬鈴薯Y病毒屬是植物病毒最大的一個(gè)屬，能侵染多種單子葉和雙子葉植物，在全世界范圍造成巨大危害[19-20]。三葉草黃脈病毒作為其中重要成員，可侵染白三葉草[21]、蠶豆、豌豆、豇豆及多種豆科作物。生產(chǎn)中，ClYVV可以通過(guò)蚜蟲(chóng)廣泛傳播，嚴(yán)重影響侵染對(duì)象的產(chǎn)量和品質(zhì)，該病毒病在世界多個(gè)國(guó)家均有發(fā)生。

中國(guó)蠶豆種植面積位居世界首位，江蘇是中國(guó)傳統(tǒng)的蠶豆種植省份，常年種植面積達(dá)1.333×105hm2左右[22]。但目前針對(duì)蠶豆上的病毒病研究相對(duì)較少。2018年，在鹽城、南通、泰州等地蠶豆調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，ClYVV廣泛存在于蠶豆生產(chǎn)中，重發(fā)田塊發(fā)病率達(dá)50%～60%。由于該病毒寄主范圍較廣，易通過(guò)蚜蟲(chóng)或汁液機(jī)械傳毒至其他寄主植物，存在潛在流行危害風(fēng)險(xiǎn)。因此，生產(chǎn)中應(yīng)當(dāng)密切關(guān)注該病毒病的發(fā)生，做好病毒的早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，適時(shí)控制傳毒介體蚜蟲(chóng)，切斷傳毒途徑，控制該病毒病發(fā)生與擴(kuò)散，減少損失。