多枝檉柳葉片響應NaCl脅迫的轉錄組分析

陳亞輝， 張師瑒， 楊慶山， 宋志忠， 姜 姜

(1.南京林業大學林學院，江蘇南京210037；2.不列顛哥倫比亞大學理學院，溫哥華V6T 1Z4；3.山東省林業科學研究院鹽堿地造林試驗站，山東濟南250000；4.魯東大學農林工程研究院，山東煙臺264039)

鹽漬土在全球分布廣泛，其土壤中鹽分含量高，土壤理化性質差，嚴重危害植物的生長發育[1-3]。鹽漬土含有大量的Na+類鹽分，Na+能夠破壞蛋白質和膜的穩定性，產生滲透脅迫和離子毒害，導致細胞內活性氧ROS(Reactive oxygen species)信號的產生，使植物細胞功能紊亂，影響植物正常生長，嚴重時會導致植物死亡[4-6]。近二十年來，受全球人類活動和氣候變化的影響，鹽漬土面積不斷擴大[7]，如何科學修復鹽漬化土壤和改善生態環境成為學者們關注的熱點[8]。

多枝檉柳(TamarixramosissimaLcdcb)屬于雙子葉泌鹽鹽生植物[9]，能通過被稱為囊狀毛狀體或“鹽腺”的特殊結構將鹽從葉片表面排出[10]。在長期進化過程中，多枝檉柳形成了耐鹽、耐干旱、抗風沙等優良特性，以適應惡劣的生存環境。在檉柳屬植物中，對剛毛檉柳(TamarixhispidaWilld.)耐鹽分子機制的研究較為深入。Lei等[11]發現在150 mmol/L NaCl脅迫條件下，剛毛檉柳ThCOL2基因過表達后，可通過調控保護酶的活性并降低體內O2·-和H2O2的積累，進而增強轉基因剛毛檉柳對ROS的清除能力，以減少細胞損傷和死亡，增強植物對鹽脅迫的適應能力。因此，推測ThCOL2基因能夠響應鹽脅迫。王培龍等[12]在剛毛檉柳中通過克隆獲得ThPP2C基因，研究發現該基因參與植物耐鹽脅迫和脫落酸、茉莉酸等激素應答。此外，有關多枝檉柳耐鹽研究多集中在其在鹽脅迫條件下的生長和生理響應，如魯艷等[13]發現低濃度(≤100 mmol/L)NaCl脅迫會促進多枝檉柳的生長，而高濃度(≥200 mmol/L)NaCl脅迫則抑制其生長；劉詠梅等[14]采用液體培養法分析了甘肅檉柳(T.gansuensisH.Z.Zhang)、多枝檉柳和細穗檉柳(T．leptostachysBunge)3種檉柳材料在不同濃度NaCl脅迫條件下的生理指標和SOS1基因的表達水平，結果表明，3種多枝檉柳表現出較強的耐鹽能力，可將多枝檉柳作為檉柳屬代表性植物進行耐鹽機制研究。

近年來，轉錄組測序(RNA-Seq)技術已被廣泛用于植物抗逆研究，對揭示植物耐鹽的分子機理起到推動作用[15-16]。WRKY、bHLH、bZIP、NAC、MYB、AP2/ERF等轉錄因子均參與鹽脅迫[17-27]。張惠媛等[17]的研究結果表明，小麥WRKY轉錄因子基因TaWRKY33受鹽脅迫誘導表達，提高了轉基因擬南芥和小麥的耐鹽性；屈興紅等[28]研究發現WRKY轉錄因子通過調控相關基因來參與調控超氧化物歧化酶(SOD)等氧化還原酶基因的轉錄表達以適應鹽脅迫；練冬梅等[29]發現黃秋葵在鹽脅迫處理24 h后，MYB4轉錄因子基因呈上調表達，黃秋葵幼苗耐鹽性增強；Wang等[30]研究剛毛檉柳ThbZIP1基因時，發現過表達ThbZIP1可以增強過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶的活性，并增加可溶性糖和可溶性蛋白質的含量，這表明ThbZIP1是通過介導多種生理途徑的信號傳導來促進耐鹽性。此外，MAPK(Mitogen-activated protein kinase)級聯是廣泛存在于真核生物中重要的信號轉導途徑[31]，參與植物生長發育及對鹽脅迫的應答反應。它由MAPKKK-MAPKK-MAPK3類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成，通過磷酸化將信號進行傳遞和放大[32]。MAPK級聯反應途徑作用于下游靶蛋白進而激活相應的抗逆基因表達，調節滲透平衡、離子平衡以及氧化還原平衡，從而提高植物抵抗逆境脅迫的能力。有研究結果表明MKK4/5-MAPK3/MAPK6在信號傳遞過程中通過未知的機制啟動轉錄因子WRKY22/WRKY29，誘導防御基因的表達[33]。Teige等[34]研究發現擬南芥中AtMEKK1-AtMAPKK2-AtMAPK4/AtMAPK6反應途徑在抵抗鹽脅迫中發揮重要作用，能夠提高對鹽脅迫的抗性。

本研究以多枝檉柳為研究材料，通過高通量轉錄組測序篩選200 mmol/L NaCl脅迫處理下葉片中的差異表達基因，并利用qRT-PCR驗證候選基因的表達差異，從轉錄水平揭示多枝檉柳響應鹽脅迫的關鍵基因及其潛在的調控網絡，為研究檉柳屬植物耐鹽機制提供理論支撐和基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試多枝檉柳由山東省林業科學院東營試驗基地提供，試驗于2019年10月-2021年3月在南京林業大學林木遺傳育種與生物技術重點實驗室完成。選取5個月苗齡、長勢相近的多枝檉柳扦插苗轉移至盛有1/2 Hoagland營養液的24孔水培箱(尺寸為40 cm×30 cm×16 cm)中，放置于溫度(26±2) ℃、相對濕度40%～55%的溫室大棚中馴化培養2個月后備用。

1.2 試驗處理

試驗設置對照組和處理組，每組8株，3次重復。以1/2 Hoagland營養液培養多枝檉柳為對照組(CK)，以添加200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland營養液培養多枝檉柳為處理組，每3 d更換1次培養液。分別在處理0 h、48 h、168 h時采集葉片樣品，并立即放置于液氮中處理，然后移至-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 轉錄組測序

液氮處理后的葉片樣品送往基迪奧生物科技(廣州)有限公司進行高通量轉錄組測序。采用Illumina HiSeqTM4000將純化后的PCR產物根據標準操作在平臺上進行雙端測序(PE150)分析，利用Fastp軟件進行質量控制，對原始數據進行數據過濾，得到過濾后的數據，使用Trinity軟件[35]對過濾后的數據進行組裝。首先將具有一定長度的重疊的過濾后的數據連成更長的片段，通過數據重疊得到不含高于RawReads百分比的組裝片段，組裝出Unigene，再使用BLAST2 GO[36]和KOBAS[37]得到GO功能和KEGG注釋。

1.4 差異基因篩選

使用DESeq2[38]軟件對測序所得的reads count數據進行分析，得到最終正確的FDR值(經過BH校正后的P值)，FDR<0.05被認為是顯著富集。基于差異分析結果，我們篩選FDR<0.05且|log2FC|>1的基因為顯著差異基因。

1.5 qRT-PCR驗證

利用Omega Bio-Tek公司(美國)的Omega試劑盒提取葉片材料的總RNA，采用寶生物工程 (大連) 有限公司 的PrimerScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒將其反轉錄成1鏈cDNA作為模板。設計DEGs特異性表達引物，使用賽默飛世爾科技(中國)有限公司的PowerUpTMSYBR Green Master mix試劑，在應用生物系統ABI ViiATM7 Real-time PCR system儀器進行qRT-PCR檢測，所用引物見表1，每個候選基因進行4次技術重復，3次生物學重復。以Actin為內參基因，用2-△△Ct法[39]進行相對表達量的計算。

表1 特異性表達引物序列

1.6 數據處理

使用Excel進行數據統計，使用SPSS 26.0進行顯著性分析，使用Origin 2018軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序質量分析

2.1.1 轉錄組數據分析 利用IlluminaHiSeqTM4000進行高通量轉錄組測序，在200 mmol/L NaCl脅迫條件下，多枝檉柳葉片在處理0 h、48 h和168 h時均得到多條高質量堿基序列(堿基長度：6 017 997 220～6 782 061 623 bp)，且Q20、Q30分別達到95%以上和90%以上，且G+C含量均達到44%以上(表2)，表明本研究開展的轉錄組測序質量較高，符合進一步研究的要求。

表2 堿基信息統計表

2.1.2 Unigene基本注釋 轉錄組測序結果顯示，共拼接獲得105 702個Unigene，在NR、KEGG、KOG和SwissProt數據庫中獲得基因注釋的Unigene分別有53 385個、46 062個、31 587個和36 087個，同時在這4個數據庫均有注釋的Unigene共27 670個(圖1)。

圖1 NaCl脅迫下多枝檉柳葉片表達基因注釋到4大數據庫的韋恩圖

2.2 差異表達基因數量分析

將多枝檉柳在NaCl脅迫處理后0 h、48 h和168 h的轉錄數據與對照進行比較，以FDR<0.05且|log2FC|>1篩選差異表達基因。在CK-0 h與200 mmol/L NaCl-48h比較組中共檢測到11 754個基因的表達水平發生改變，其中6 374個基因的表達水平上調，5 380個基因的表達水平下調；在200 mmol/L NaCl-48 h與200 mmol/L NaCl-168h比較組中共11 645個基因表達發生了改變，有3 837個基因的表達水平受NaCl脅迫誘導上調，7 808個基因的表達水平受抑制下調；在CK-0 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組中共檢測到7 768個基因的表達發生改變，其中2 542個基因受NaCl脅迫誘導上調，5 226個基因的表達水平受抑制下調(圖2)。

A表示CK-0 h；B表示200 mmol/L NaCl-48 h；C表示200 mmol/L NaCl-168 h。CK-0 h、200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-168 h見表2注。

2.3 差異表達基因的GO分析

通過GO注釋分析，上述差異表達基因(DEGs)可分為生物過程、細胞組分和分子功能3大類別，共51個不同分類組(圖3)。在生物過程大類中，DEGs主要富集在細胞過程、代謝過程、單有機體過程和刺激響應中；在分子功能大類中，DEGs主要富集在催化活性、結合、轉導活性和結構分子活性；在細胞成分大類中，DEGs主要富集在細胞、細胞部分、細胞器和膜。此外，隨著NaCl脅迫時間的延長，上調的DEGs數量顯著減少，且DEGs整體數量下降。由此推測，隨著高鹽脅迫時間的延長，多枝檉柳葉片在轉錄水平有大量DEGs表達水平出現下調。

A表示CK -0 h；B表示200 mmol/L NaCl-48 h；C表示200 mmol/L NaCl-168 h。CK-0 h、200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-168 h見表2注。

2.4 差異表達基因的KEGG富集分析

對上述DEGs進行KEGG富集分析，根據其不同的代謝和信號通路可分為5個KEGG通路分支，包括代謝、遺傳信息處理、環境信息處理、有機系統和細胞過程，這5個通路分支又進一步分成19個小類(圖4)，更加直觀地顯示了多枝檉柳在鹽脅迫下發生調節和改變的代謝過程和信號通路。特別地，CK-0 h與200 mmol/L NaCl-48 h比較組中參與代謝、遺傳信息處理、環境信息處理、有機系統和細胞過程通路分支的差異基因分別為1 882個、716個、132個、121個和99個。在200 mmol/L NaCl-48 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組中參與代謝、遺傳信息處理、環境信息處理、有機系統和細胞過程等通路分支的差異基因分別為1 700個、446個、146個、103個和87個。在CK-0 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組中參與代謝、遺傳信息處理、環境信息處理、有機系統和細胞過程等通路分支的差異基因分別為1 514個、545個、121個、80個和69個。在3個比較組中，參與代謝通路分支的差異表達基因最多，參與細胞過程通路分支的差異表達基因最少。此外，隨著高鹽脅迫時間的延長，5個KEGG通路分支的DEGs數量均逐漸下降，其中，遺傳信息處理通路中的下降最為明顯。

A表示CK-0 h；B表示200 mmol/L NaCl-48 h；C表示200 mmol/L NaCl-168 h。CK-0 h、200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-168 h見表2注。a:代謝；b：遺傳信息處理；c：環境信息處理；d：有機系統；e：細胞過程。

2.5 差異表達基因的KEGG通路分析

由KEGG通路分析結果可知，在CK-0 h與200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-48 h與200 mmol/L NaCl-168 h和CK-0 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組中分別注釋到的1 762個、1 426個和1 366個DEGs，并分別富集到129個、133個和127個KEGG通路中(圖5)，更加直觀地反映出植物鹽脅迫下是哪些代謝通路的表達發生了變化。其中，在CK-0 h與200 mmol/L NaCl-48 h比較組中，在前20個KEGG通路中，核糖體(ko03010)注釋到435個DEGs，占24.69%，其后依次是次生代謝物的生物合成(ko01110)、植物病原體相互作用(ko04626)、苯丙烷生物合成(ko00940)、植物激素信號轉導(ko04075)和植物MAPK信號通路(ko04016)，分別注釋到416個(23.61%)、88個(4.99%)、69個(3.92%)、69個(3.92%)和59個(3.35%)DEGs。200 mmol/L NaCl-48 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組在前20個通路中，代謝途徑(ko1100)通路注釋到684個DEGs，占47.97%；其后依次是次生代謝物的生物合成(ko01110)、植物激素信號轉導(ko04075)、植物病原體相互作用(ko04626)、植物MAPK信號通路(ko04016)和苯丙烷生物合成(ko00940)等，分別注釋到382個(26.79%)、82個(5.75%)、72個(5.05%)、64個(4.49%)和59個(4.14%)DEGs。CK-0 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組在前20個通路中，代謝途徑(ko1100)通路注釋到614個DEGs，占44.95%；其后依次是次生代謝物的生物合成(ko01110)、核糖體(ko03010)、植物激素信號轉導(ko04075)、植物病原體相互作用(ko04626)和植物MAPK信號通路(ko04016)等，分別注釋到351個(25.70%)、296個(21.67%)、72個(5.27%)、63個(4.61%)和49個(3.59%)DEGs。由此可知，多枝檉柳受到高鹽脅迫后，DEGs在代謝途徑、次生代謝物的生物合成、植物激素信號轉導、植物病原體相互作用、植物MAPK信號通路和苯丙烷生物合成等KEGG通路上顯著富集。

A表示CK-0 h；B表示200 mmol/L NaCl-48 h；C表示200 mmol/L NaCl-168 h。CK-0 h、200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-168 h見表2注。

2.6 注釋到KEGG通路的關鍵差異表達基因分析

轉錄因子在調控植物生長發育、適應環境中起到主要作用，尤其是在響應鹽脅迫中具有重要作用。本研究有8個差異表達轉錄因子基因注釋到KEGG通路中，主要為WRKY和bZIP 2種類型。

注釋到KEGG通路(ko04626和ko04016)中響應鹽脅迫的WRKY轉錄因子基因共5個，其中Unigene0010090、Unigene0077293和Unigene0079542在處理0 h、48 h和168 h時的表達水平呈先下降后上升趨勢，而Unigene0014406和Unigene0024962在處理0 h、48 h和168 h時的表達水平一直呈上升趨勢(表3)。有3個bZIP轉錄因子基因注釋到KEGG通路(ko04016、ko01100、ko01110、ko01200、ko01212、ko04146、ko00071、ko00640、ko00410、ko01040、ko00592和ko04075)來參與鹽脅迫的調控，其中Unigene0026888和Unigene0008868在處理0 h、48 h和168 h時的表達水平呈先上升后下降趨勢，而Unigene0010561在0 h、48 h和168 h時的表達水平呈先下降后上升趨勢(表3)。

表3 注釋到KEGG通路的轉錄因子基因

2.7 KEGG通路中MAPK信號轉導途徑分析

MAPK級聯是重要的信號轉導途徑，參與植物生長發育及對鹽脅迫的應答反應等生理過程。由圖6可知，CK-0 h與200 mmol/L NaCl-48 h和200 mmol/L NaCl-48 h與200 mmol/L NaCl-168 h比較組在KEGG 通路中，DEGs表達水平發生顯著變化。

由圖6可知，本研究中共有16個DEGs參與NaCl脅迫條件下MAPK信號轉導途徑。在病原體攻擊——細胞死亡和H2O2產生(圖6A)信號傳遞過程中MKK4/MKK5、MPK3/MPK6和WRKY22/WRKY29含有的基因(Unigene0054151、Unigene0055797和Unigene0070215)、病原體攻擊—— 植物防御中活性氧的積累(圖6A)信號傳遞過程中MPK4含有的基因(Unigene0016609)以及鹽——耐鹽性(圖6B)信號傳遞過程中MKK4/6含有的基因(Unigene0016609)表達均在0 h、48 h和168 h呈先下降后上升趨勢。

圖6A表明，H2O2可以激活ANP1-MKK4/MKK5-MAPK3/MAPK6信號途徑來調節相關基因的表達。本研究中，多枝檉柳在受到鹽脅迫后，信號從MKK4/MKK5傳遞到MPK3/MPK6過程中，在NaCl處理168 h時可能啟動了WRKY22/WRKY29防御基因，導致表達上調(圖6A、表4)；同時，鹽脅迫下MEKK1被激活后，又激活了MKK2，再直接靶向MPK4/MPK6，組成MEKK1-MKK2-MPK4/MPK6模塊介導抵御鹽脅迫的應答反應(圖6B、表4)。此外，在病原體攻擊—— 植物防御中活性氧積累的信號傳遞過程中，MEKK1在鹽脅迫下被激活，傳遞給未知機制，再到達MPK4，最終形成一個防御活性氧積累信號。其中，圖6A中的MPK4和圖6B中的MPK4/MPK6中都包含相同基因(Unigene0016609)，且激活過程相近。由此推斷，鹽脅迫下在病原體攻擊—— 植物防御中活性氧積累的信號傳遞過程中，可能是MKK2激活了MPK4。

在鹽脅迫——脅迫適應信號傳遞過程中，由脫落酸(ABA)信號傳遞給PYR/PYL信號，在PYR/PYL信號傳遞中有2個基因(Unigene0071368和Unigene0030832)表達在鹽脅迫0 h、48 h和168 h后呈先下降后上升趨勢；有3個基因(Unigene0011883、Unigene0017324和Unigene0005290)表達在鹽脅迫0 h、48 h和168 h后呈先上升后下降趨勢。當信號傳遞到PP2C時，有3個基因(Unigene0002530、Unigene0087395和Unigene0051628)在0 h、48 h和168 h時表達先上調后下調，與信號傳遞到SnRK2時Unigene0056876基因的表達一致。信號傳遞到MAPKKK17/MAPKKK18時，有1個基因(Unigene0025820)在0 h、48 h和168 h時表達一直下調。經MAPKKK17/MAPKKK18信號傳遞到MPK1/MPK2時，Unigene0064719基因表達在0 h、48 h和168 h中呈先下降后上升趨勢(圖6C，表4)。由此可以推論，在ABA信號中SnRK2起主要的調控作用。多枝檉柳受到高鹽脅迫后，SnRK2與ABA結合的PYR/PYL蛋白和PP2C相互作用并抑制其活性，使SnRK2始終保持磷酸化活性狀態，來激活脅迫響應途徑。

A：病原體攻擊——細胞死亡和H2O2產生;B:鹽——耐鹽性;C:鹽脅迫——脅迫適應。a：CK1-0 h;b：CK2-0 h;c：CK3-0 h;d：NaCl1-48 h;e：NaCl2-48 h;f：NaCl3-48 h;g：NaCl1-168 h;h：NaCl2-168 h;i：NaCl3-168 h；CK1-0 h、CK2-0 h、CK3-0 h、NaCl1-48 h、NaCl2-48 h、NaCl3-48 h、NaCl1-168 h、NaCl2-168 h、NaCl3-168 h見表2注。

表4 MAPK信號途徑相關的KEGG基因注釋

2.8 qRT-PCR驗證

本研究隨機選取8個與耐鹽相關的DEGs進行qRT-PCR驗證，結果(表5)顯示，Unigene0104732、Unigene0083695和Unigene0069097基因表達水平受NaCl脅迫誘導呈先上升后下降趨勢；Unigene0024962響應NaCl脅迫，表達水平顯著上升，Unigene0090596、Unigene0007135和Unigene0088781基因表達水平受NaCl脅迫影響先下降后上升，而Unigene0028215基因表達水平受NaCl抑制顯著下降。qRT-PCR驗證結果與轉錄組測序分析結果完全一致(圖7)，證明本研究所得的轉錄組數據是準確可靠的，可為研究多枝檉柳耐鹽機制提供基因資源和轉錄水平依據。

表5 qRT-PCR驗證差異表達基因的表達變化

CK-0 h、200 mmol/L NaCl-48 h、200 mmol/L NaCl-168 h見表2注。

3 討論

檉柳屬(TamarixLinn.)植物在適應環境的長期過程中演變出一系列復雜的機制抵抗鹽脅迫。從分子層面來講，植物響應鹽脅迫是一個多基因參與及調控的復雜過程，涉及代謝、信號傳導、能量產生和運輸、離子滲透和轉運等諸多通路的相關基因[40-41]。因此，對多枝檉柳植物進行全面的轉錄組分析，有助于揭示檉柳屬植物應答鹽脅迫環境的響應機制。

檉柳屬植物長期以來進化出復雜的調節網絡以適應非生物脅迫的不利逆境[42]，轉錄因子是所有非生物脅迫反應中最重要的調節因子[43]。WRKY是轉錄因子的大家族之一，已被證明參與多種代謝過程，并在與植物生物脅迫和非生物脅迫反應相關的轉錄重編程調節中發揮重要作用[44-46]。本研究中，編碼WRKY轉錄因子的Unigene0024962在200 mmol/L NaCl處理48 h和168 h后表達水平呈上升趨勢，WRKY轉錄因子編碼基因Unigene0079542的表達水平在200 mmol/L NaCl處理48 h時出現下降，而在168 h時呈上升，表明隨著鹽脅迫時間的變化，Unigene0079542響應鹽脅迫的方式發生了改變，與大豆[47]和長葉紅砂[48]中WRKY轉錄因子編碼基因受NaCl處理而上調的報道相類似。然而，與本研究結果相反的是，Lin等[49]發現辣椒CaWRKY27基因在轉錄水平的表達量受NaCl脅迫而下調。本研究發現WRKY轉錄因子Unigene0014406持續受NaCl脅迫處理的誘導，暗示該基因可能持續參與鹽生植物多枝檉柳響應鹽脅迫的應答反應。此外，bZIP轉錄因子在植物生長和環境脅迫應答中發揮重要的調控作用[50-51]。多枝檉柳葉片中bZIP轉錄因子編碼基因Unigene0008868表達受NaCl誘導而顯著上調，這與Huang等[52]在苧麻中發現的bZIP2表達規律相似，并暗示bZIP轉錄因子在植物對高鹽脅迫的響應中起重要的調控作用。同時，MYB是植物體內數量和功能最多樣化的轉錄因子家族之一，在非生物脅迫中也起到非常重要的作用[53-55]。本研究中MYB編碼基因Unigene0088781在多枝檉柳葉片中的表達水平受NaCl脅迫先下降后上升，暗示該基因在受NaCl脅迫一定時間后才開始響應鹽脅迫，類似現象已在紫花苜蓿幼苗[56]和玫瑰花瓣[57]中報道。綜上可知，WRKY、MYB和bZIP等轉錄因子參與多枝檉柳應答鹽脅迫的調控過程。

植物MAPK級聯的功能包括參與生長發育、抗病反應、非生物脅迫應答和激素信號轉導等過程[58-64]。已有研究結果表明，MEKK1-MPK4能夠介導水稻的鹽脅迫信號，水稻在鹽脅迫下，OsMEKK1基因的表達受鹽脅迫誘導上調，且OsMEKK1會磷酸化OsMPK4，而NaCl脅迫激活水稻中OsMEKK1和OsMPK4的酶活性進而調控水稻對NaCl的耐受性，并且MEKK1-MPK4級聯通過調控相關轉錄因子的表達介導鹽信號[31,65]。Mehlmer等[66]研究發現在擬南芥中，鹽脅迫下的MKK2-MPK4/MPK6途徑負責適應鹽脅迫。與前人研究結果[66]相同的是，本研究中多枝檉柳可能也是通過MEKK1-MPK4和MKK2-MPK4/MPK6途徑響應鹽脅迫信號。此外，MAPK級聯還參與植物多種激素信號，包括水楊酸(SA)[67]、生長激素(AUX)[68]、脫落酸(ABA )[69]和茉莉酸(JA)[70]等，其中，脫落酸參與高等植物生長發育、抗逆等生理過程，在非生物脅迫中起著關鍵作用，高鹽、高溫等非生物脅迫可刺激植物體內脫落酸的合成，并啟動相關信號途徑來激活植物抗逆機制[71]。ABA-PYR-PP2C-SnRK2負責脫落酸信號感應和傳遞的中央信號轉導復合體，PYR/PYL/RCAR家族成員幾乎都參與了脫落酸信號轉導途徑[72-73]。本研究中多枝檉柳在NaCl脅迫下也可能形成PYR-PP2C-SnRK2信號轉導復合體，進而參與脫落酸激活，啟動抗鹽機制。

4 結論

在高鹽脅迫下，WRKY、MYB和bZIP等轉錄因子參與多枝檉柳的耐鹽調節過程；高鹽脅迫下多枝檉柳的MAPK信號轉導途徑被激活，通過多種途徑調節相關轉錄因子基因表達響應鹽脅迫。本研究為進一步研究多枝檉柳耐鹽分子機制提供了基礎。