基于表型性狀和KASP標記的玉米DUS測試品種的聚類分析

王艷平， 潘 紅， 吳 燕， 王顯生， 汪鴻星， 李華勇， 于 堃， 沈 奇

(江蘇省農業科學院種質資源與生物技術研究所，江蘇南京210014)

玉米是中國種植范圍最廣、用途最多、總產量最高的作物，玉米產業的發展在保障中國糧食安全和滿足市場需要方面具有至關重要的作用[1]。良種培育是保證玉米正常生產的關鍵，近年來國家對種業研發提供了大量政策支持，提高了企業研發的積極性。2014年中國頒布了《國家級水稻玉米品種審定綠色通道試驗指南》(簡稱《指南》)以簡化審定程序，隨后，中國審定的玉米品種數量迅猛增長。近3年來，中國每年審定的玉米品種有2 000～3 000份，每年申請品種保護的玉米品種有2 000多份[2]。2016年中國實施的新《種子法》中規定，獲得品種保護和審定的玉米品種都要滿足品種特異性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和穩定性(Stability)(簡稱DUS)測試的要求，目前中國每年都有大量玉米品種接受DUS測試。

DUS 測試是品種權授權、品種審定和品種登記的基本技術依據，其中特異性測試在真實性評價、假冒侵權品種技術鑒定中尤為重要。特異性是指一個植物品種有一個以上性狀明顯區別于已知品種。近似品種是指在所有已知品種中，相關特征或者特性與待測品種最為相似、在DUS測試中用于田間比對的品種。由此可見，篩選近似品種是DUS測試的重要環節，對特異性的判定起著決定性作用。當前，特異性測試主要是根據植物測試指南中表型性狀的描述，在已知品種庫中篩選與申請品種表型近似的品種并進行田間種植比較。這種根據表型性狀篩選近似品種的測試方法在DUS測試實踐中存在一些缺陷：一是耗時長，必須對申請品種進行一年的種植試驗，獲得表型性狀數據后才能與數據庫中的所有品種進行比對；二是現有的植物新品種保護數據庫包括全國各生態區的測試數據，直接用不同生態區的表型性狀數據進行比對時存在環境誤差。

分子數據因具有標記位點多、檢測快速準確、不受環境因素影響等優點，在篩選近似品種方面能夠高效鑒定大量的品種。國際植物新品種保護聯盟(UPOV)技術委員會于1992年成立了生物化學和分子技術工作組(BMT)，專門研究DNA分子標記在DUS測試中的應用。目前，研究者主要運用簡單重復序列(SSR)分子標記輔助DUS測試。UPOV認為，SSR標記是可以用于構建DNA指紋數據庫的一種理想的分子標記，并為其應用制定了相應的技術文件指導[3]。Hong等[4]用表達序列標簽-SSR(EST-SSR)標記構建了萵苣DNA指紋數據庫，并將其用于萵苣品種的近似品種篩選和特異性判定。中國在2013年發布了玉米等10多種作物的SSR標記法品種鑒定技術規程。農業農村部植物新品種測試(濟南)分中心采用發布的技術規程構建了小麥、大白菜已知品種的DNA指紋數據庫，并用DNA指紋數據庫篩選了小麥DUS測試品種的近似品種[5]。

目前使用的品種鑒定技術規程——SSR分子標記法，標記數目有限、信息量較少，且不能滿足大量樣本高通量檢測的需求。近年來，由于芯片技術具有標記數量多、自動化程度高等優點，利用其研發的單核苷酸多態性(SNP)檢測技術得到快速發展和應用[6-7]。法國專家Delêtre[8]在2020年的UPOV生物化學和分子技術工作組第19次會議上講述了一種用SNP分子標記檢測冬油菜DUS的策略，美國的Achard等[9]已將SNP技術運用到大豆品種保護的DUS測試中。

SNP檢測技術中的競爭性等位基因特異性PCR(Kompetitive allele-specific PCR，KASP)標記檢測法具有穩定性高、準確性高、成本低的特點，可用于各種目的、各種物種的基因分型，在需要少量到中等數量標記的檢測中可顯示成本效益和可擴展的靈活性[10]，目前已被廣泛應用到大麥[11]、小麥[12]、水稻[13]、玉米[14-16]等作物品種的檢測中。陸海燕等[14]基于205份玉米自交系重測序數據, 過濾出1 660 336個SNP位點, 并根據這些位點開發、挑選出202個能有效鑒定玉米品種特異性和真實性的KASP標記。江蘇省于2020年發布了利用KASP標記檢測的地方標準《玉米品種及純度鑒定技術規程SNP標記法》(DB32/T 3860-2020)[17]，該標準推薦了優先使用的40個KASP標記。本研究利用表型性狀和上述標準中可用于品種鑒定的40個KASP分子標記，分別對315份玉米的DUS測試品種進行聚類，分析玉米DUS測試品種群體的遺傳多樣性，初步探討KASP標記在玉米DUS測試中應用的潛力，以期為玉米DUS測試中近似品種的篩選提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

315份玉米DUS測試品種(表1)，來源于農業農村部植物新品種測試(南京)分中心，繁殖類型包含223份單交種、92份自交系，品種類型包含163份普通型、63份甜質型、55份糯質型和34份甜糯混合型。供試玉米材料來源廣泛，大部分品種來源于長江中下游地區的江蘇、浙江、上海、安徽等地，少數品種來源于湖北、河北、河南、山東、天津、北京、四川、福建、江西、廣東等地。

表1 供試玉米品種

1.2 表型數據的采集及聚類分析

試驗材料于2020、2021年春種植于江蘇省農業科學院溧水植物科學基地。按照《植物品種特異性、一致性和穩定性測試指南 玉米》(GB/T 19557.24-2018)[18]規定的測試方法對測試指南中列出的43個基本性狀進行觀測和記錄，目測性狀用代碼記錄，測量性狀用測量值記錄。使用SPSS 26軟件，采用對數似然值距離測量以及施瓦茨貝葉斯準則(BIC)進行二階聚類，用歐氏距離構建系統聚類圖。

1.3 KASP標記的基因分型及聚類

在玉米的3～4葉期，每個品種剪取5株幼苗的葉片，參照《玉米品種及純度鑒定技術規程SNP標記法》(DB 32/T 3860-2020)[17]中列出的40個KASP標記，按照本標準規定的方法提取樣品DNA并進行PCR擴增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，委托南京集思慧遠生物科技有限公司進行基因分型。使用TASSEL 5軟件，通過Neighbor-Joining方法構建進化樹，用FigTree軟件處理聚類圖。

2 結果與分析

2.1 玉米表型性狀的聚類分析

由表2可以看出，將基于43個玉米表型性狀的數據進行二階聚類，315份玉米品種被聚為3類，第1類有162份品種，除1份為糯質型外，其他全部為普通型；第2類有92份品種，除2份為甜質型，2份為普通型外，其他全部為糯質型或甜糯混合型；第3類有61份品種，全部為甜質型。

表2 315份玉米品種基于表型性狀數據的二階聚類分布

對43個玉米表型性狀的重要性進行預測，由圖1可以看出，“籽粒:類型”、“(僅適用于單色玉米)籽粒:頂端主要顏色”、“雄穗:一級側枝數目”和“幼苗:第一葉鞘花青苷顯色強度”這4個性狀的重要性在0.5以上，對聚類的貢獻排名位于前4名。

編號1～43采用的是測試指南《植物品種特異性、一致性和穩定性測試指南 玉米》(GB/T 19557.24-2018)中規定的性狀序號。

對315份玉米品種的表型性狀觀測數據進行系統聚類，并將聚類結果整理成表3、圖2。以歐氏距離25.0為標準，可將315份玉米材料劃分為A、B兩大類群。A類群包含273份玉米品種(包括58份自交系和215個單交種)，單交種除6份玉米品種聚于B群外，全部聚于A類群。B類群包含42份玉米品種，其中36份玉米品種是自交系，占全部自交系數量的39.1%。以歐氏距離12.5為標準，可將A類群劃分為A1、A2和A3等3個亞群，其中A1亞群包含154份玉米品種，其中17份為自交系(占全部自交系數量的18.5%)，137份為單交種(占全部單交種數量的61.4%)；A2亞群包含115份玉米品種，其中74份為單交種，41份為自交系；A3亞群包含4份玉米品種，全部是單交種。以歐氏距離10.0為標準，可將A2亞群再劃分為A2-1、A2-2這2個亞群，其中A2-1亞群包含76份玉米品種，其中70份為單交種(占全部單交種數量的31.4%)，6份為自交系；A2-2亞群包含39份玉米品種，其中35份為自交系(占全部自交系數量的38.0%)，4份為單交種。從品種類型來看，B類群包含29份普通型、7份甜質型、5份糯質型和1份甜糯混合型。A1亞群包含82份普通型、36份甜質型、18份糯質型和18份甜糯混合型；A2亞群包含58份普通型、21份甜質型、19份糯質型和17份甜糯混合型；A3亞群包含4份玉米品種，全部是普通型。A2-1亞群包含19份普通型、19份甜質型、21份糯質型和17份甜糯混合型；A2-2亞群全部是普通型。上述系統聚類結果顯示，單交種和自交系在表型上的分離相對比較明顯，普通型與甜質型、糯質型、甜糯混合型在表型上的分離較明顯，而甜質型、糯質型、甜糯混合型三者之間的分離不明顯。

圖2 不同類型玉米品種在所劃分類群中的分布

表3 不同類型玉米品種在各類群中的分布

2.2 KASP標記聚類分析

采用覆蓋玉米10條染色體的40個KASP標記對315份玉米品種進行基因分型，每條染色體設4對多態性引物。這40個KASP標記位點在315份玉米品種群體中的多態信息含量(PIC)變化范圍為0.430～0.500，平均值為0.482，最小等位基因頻率(MAF)變化范圍為0.313～0.498, 平均值為0.420，表明所采用的40個KASP標記具有較高的特異性和穩定性。

用Neighbor-Joining法對315份玉米品種進行聚類。由圖3可以看出，315份玉米品種分成A、B兩大群，其中A群包含154份玉米品種，除2個甜質型、7份糯質型外全為普通型；B群包含161份玉米品種，其中除17份為普通型外，其他為甜質型、糯質型和甜糯混合型。B群又可分成為B1、B2、B3和B4 4個亞群，其中B1亞群包含64份玉米品種，除2份為糯質型、2份為甜糯混合型外，其他全部為甜質型。B2亞群包含79份玉米品種，B3亞群包含7份玉米品種，B2、B3這2個亞群中除9份為普通型外，其他全部為糯質型、甜糯混合型。B4亞群包含11份玉米品種，其中2份為糯質型，1份為甜糯混合型，8份為普通型。

圖3 315份玉米品種的KASP標記基因分型聚類結果

上述聚類結果顯示，在DNA水平上，普通型玉米與甜質型、糯質型和甜糯混合型玉米明顯分離，甜質型玉米與糯質型、甜糯混合型玉米也明顯分離，而糯質型和甜糯混合型玉米是相互交織，沒有出現明顯分離。在繁育類型上，單交種和自交系沒有各自成群，自交系與單交種交織在一起。

3 討論與結論

目前，植物品種的DUS測試仍然是以表型性狀的觀測數據為依據，但是分子標記尤其是SNP標記技術的應用越來越受到重視[19-23]，UPOV已經將SNP標記作為農作物品種鑒定和指紋數據庫構建的方法之一[24]。

為了探討SNP標記在玉米DUS測試中的應用，本研究采用具有高穩定性、高準確性、低成本等優點的KASP標記檢測法和玉米DUS測試的表型觀測法，對315份DUS測試玉米品種群體進行聚類分析比較。供試品種涵蓋當前中國大部分地區育成的各類品種，繁育類型包括自交系和單交種，品種類型包括普通型、甜質型、糯質型和甜糯混合型。

表型性狀的系統聚類結果顯示，在繁殖類型上，單交種和自交系之間的分離比較明顯；在品種類型上，普通型與甜質型、糯質型、甜糯混合型間的分離相對較明顯，而甜質型、糯質型、甜糯混合型三者之間的分離不太明顯。通過表型的二階聚類，將品種類型分為普通型、甜質型、糯質型+甜糯混合型3類，甜質型與糯質型和甜糯混合型玉米分成不同的類群，這是因為表型性狀數據中包含類別變量和連續變量。二階聚類分析結果顯示，類別變量、連續變量具有快速、智能、準確的優點，適用于大樣本及多變量的研究[25]，并可預測每個變量的重要性。在本研究中，“籽粒:類型”性狀對聚類結果的影響最大，因此可以根據籽粒類型將供試玉米品種分成普通型、甜質型、糯質型+甜糯混合型3種類型。

在DNA水平上，針對不同繁殖類型，王鳳格等[26]利用40對SSR標記分析了中國559個代表性玉米品種資源的遺傳多樣性，發現在自交系和雜交種之間存在較小的遺傳多樣性差異。本研究的KASP標記聚類結果也顯示，單交種和自交系沒有各自成群，而是自交系與單交種交織在一起，表明單交種可能是由其中的自交系雜交而來，在親緣關系上與其父母本自交系間存在更為親近的關系。針對不同的籽粒類型，雷開榮等[27]利用SSR-PCR分子標記技術研究了不同種群玉米種質的遺傳多樣性，發現甜質型、糯質型玉米種質間的遺傳距離變異幅度總體上小于它們與普通玉米間的遺傳距離變異幅度。本研究中的KASP標記聚類結果也顯示，普通型玉米與甜質型、糯質型、甜糯混合型玉米明顯分開，同時甜質型玉米與糯質型、甜糯混合型玉米明顯分開，而糯質型玉米和甜糯混合型玉米是相互交織，表明在分子水平上普通型玉米與甜質型、糯質型、甜糯混合型玉米之間具有明顯的遺傳差異，甜質型玉米與糯質型、甜糯混合型玉米之間也具有明顯的遺傳差異，而糯質型玉米和甜糯混合型玉米之間的差異較小。這是因為甜糯混合型玉米通常是以糯玉米自交系為母本、甜糯雙隱性玉米自交系為父本雜交選育而來的[28-29]，僅糯質型玉米中引入了甜質基因。本研究結果表明，KASP標記能夠應用在玉米品種遺傳多樣性分析和DUS測試的近似品種篩選方面，可以實現快速、高效、大量樣本的高通量檢測。

綜合分析表型與KASP標記2種聚類結果發現，在繁殖類型上，單交種與自交系的表型聚類結果與分子標記聚類結果明顯不同，在籽粒類型上，4種玉米品種類型之間在表型、分子水平上的差異基本吻合，表明不同類型的玉米品種在表型上的差異與DNA水平上的差異是不完全一致的。這個結果與韓瑞璽等[30]根據SSR標記在小麥上的研究結果所得出的DNA分子水平上的遺傳相似度大小與表型距離無嚴格線性關系的結論相一致。玉米單交種的株高、果穗大小基本優于自交系，普通型、甜質型、糯質型、甜糯混合型玉米品種的籽粒外觀差異也明顯，表型聚類只能反映品種間表型上的相似程度，不能準確反映品種間DNA水平上的親緣關系，而分子標記聚類是根據DNA序列上基因型的差異，能較準確地從遺傳水平上反映各品種間的親緣關系。Achard等[9]用SNP、形態學、生理學和系譜信息對322份已知大豆品種進行研究，對SNP數據和系譜親緣數據的遺傳距離進行多變量分析，發現品種間的關聯非常相似，但是這種遺傳水平上的親緣關系不能全面反映品種間的表型差異。因此，在當前以表型為主的DUS測試中，為提高近似品種篩選的效率、減少誤差，建議設立基于SNP標記的已知品種分子數據庫，同時利用表型和分子數據庫綜合篩選近似品種。