燧心膠囊對心力衰竭大鼠心肌纖維化的保護作用

郭丹丹 于思明 李佳卓 許文婷 董柏涵

(黑龍江中醫藥大學，哈爾濱，150040)

心力衰竭(Heart Failure，HF)是心血管疾病的終末期表現和最主要的死因，幾乎所有HF患者都有左心室迅速惡化的風險，但其具體機制尚不清楚[1]。研究表明，心肌纖維化參與了HF的進展，HF患者的左心室(Left Ventricular，LV)發現了心肌膠原纖維的顯著積累[2]。因此，闡明心肌纖維化的機制，尋找抗心肌纖維化的藥物對HF的治療具有重要意義。燧心膠囊為黑龍江中醫藥大學國家級名老中醫李延教授經驗方，由真武湯與陳士鐸“引火湯”化裁而來，具有提高LV射血分數，改善HF患者的臨床癥狀的功效[3]。研究發現，心肌細胞凋亡在HF中發揮重要作用[4]。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase，AMPK)是細胞能量的感受器和代謝穩態的調節器，其激活對改善線粒體生物發生有重要作用[5]。此外，心臟AMPK活性降低被認為會增強心臟對果糖脂肪喂養大鼠缺血再灌注損傷的程度[6]。最近的研究表明，AMPK可以通過刺激核轉錄因子紅系2相關因子(Nuclear Factor-erythroid 2-related Factor 2，Nrf2)依賴地血紅素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1，HO-1)的上調來抑制氧化應激，并且在哺乳動物心肌能量代謝方面發揮著重要作用[7]。本研究建立了大鼠HF模型，探討燧心膠囊對HF大鼠心肌纖維化的保護作用及其潛在信號機制，特別關注了AMPK/Nrf2信號，為燧心膠囊治療HF提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠180～200只，體質量(200±20)g，購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(黑)2016-004，在黑龍江中醫藥大學實驗動物中心按無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級操作規程適應性喂養1周后進行實驗。本研究符合國家醫學倫理相關規定。

1.1.2 藥物 燧心膠囊由紅參、制附子、熟地黃、麥冬、五味子、丹參、茯苓、白術、澤瀉組成，為黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院自制藥，掉膠囊皮，用蒸餾水溶解后進行2次煎煮(30 min/次)，合并水煎液后進行濃縮，進行醇沉，將醇沉物用蒸餾水進行溶解，配成生藥量為5.2 g/mL的溶液，分裝滅菌，4 ℃冷藏備用；阿霉素(深圳萬樂藥業有限公司，國藥準字H44024359)；纈沙坦膠囊(湖南千金湘江藥業股份有限公司，國藥準字H20103521)。

1.1.3 試劑與儀器 Masson染液(上海碧云天生物技術研究所，批號：954264)；活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：954612、631154、687912)；RIPA裂解緩沖液(上海生工生物工程有限公司，批號：20052342)；AMPK、Nrf2、HO-1、β-肌動蛋白和辣根過氧化物酶HRP標記山羊抗鼠IgG(美國Santa Cruz公司，美國，貨號：8457516、7538219、8124337、6434719)；VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，型號：VM7型)；ASP300S型組織脫水機和Leica RM2255型全自動輪轉切片機等病理配套設備(Leica公司，德國，型號：ASP300S型和Leica RM2255型)；光學顯微鏡(Nikon公司，日本，型號：ECLIPSE MA200型)；HBS-1096B型酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司，型號：HBS-1096B型)；BIO-RAD垂直電泳儀(BIO-RAD公司，美國，Mini-Protean型)；凝膠成像儀(UVP公司，美國，型號：GelCam 310型)。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模 選60只成年雄性SD大鼠均分為對照組、模型組、燧心膠囊低劑量組、燧心膠囊中劑量組、燧心膠囊高劑量組和纈沙坦組。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水(2 mL/kg)，其余各組大鼠腹腔注射阿霉素溶液(2 mg/kg)，1次/周，連續6周，以多普勒超聲顯示左室射血分數(Left Ventricular Ejection fraction，LVEF)≤45%為HF模型成功標志[8]。

1.2.2 給藥方法 造模成功后次日，燧心膠囊低、中、高劑量組依次灌胃給予燧心膠囊(1.3 mg/kg、2.6 mg/kg、5.2 mg/kg)[9]，纈沙坦組灌胃給予纈沙坦(13.35 mg/kg)[10]，1次/d，假手術組和模型對照組給予等量生理鹽水，各組連續給藥8周。

1.2.3 檢測指標與方法 心功能檢測：末次給藥1 h后，對大鼠進行麻醉后平臥位固定，將探頭置于胸骨左緣，取左室長軸最大直徑處，標記室間隔與左室后壁收縮末和舒張末心內膜位置，采用VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀分別測量LVEF、左室縮短分數(Left Ventricular Fractional Shortening，LVFS)、左室收縮期末內徑(Left Ventricular End-systolic Dimension，LVSD)、左室舒張末內徑(Left Ventricular End-Diastolic Dimension，LVDD)，取5個心動周期求平均值。

大鼠心臟組織形態學檢查：做完心功能檢測后處死大鼠，分離心臟，沿左心室中部橫軸切取0.5 cm厚的心肌組織，進行甲醛溶液固定，剩余心臟組織進行凍存。固定的組織經脫水，包埋、切片(4 μm)后進行Masson染色，用顯微鏡觀察心臟纖維化變化。

心臟組織中ROS、GSH和SOD水平檢測：稱取100 mg心臟組織，用預冷生理鹽水沖洗3次，按1 mL/100 mg的比例加入生理鹽水，制成勻漿，離心半徑10 cm離心10 min取上清，根據試劑盒說明書檢測心臟組織中ROS、GSH和SOD水平。

蛋白質印跡法檢測心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平：稱取100 mg心臟組織，制成勻漿，加入1 mL RIPA裂解緩沖液，離心后取上清，進行電泳(30 μg/孔)、轉膜，孵育AMPK(1∶200)、Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶400)和β-肌動蛋白(1∶1 000)抗體，過夜(4 ℃)，用IgG抗體(1∶10 000)在室溫下孵育(30 min)，顯色，采集圖像進行分析。

2 結果

2.1 燧心膠囊對HF大鼠心功能的影響 與對照組比較，模型組大鼠LVEF和LVFS水平降低、LVSD和LVEDD水平升高(P<0.05)，模型組大鼠造模成功；與模型組比較，各燧心膠囊組和纈沙坦組大鼠LVEF和LVFS水平增高，LVSD和LVEDD水平降低，各燧心膠囊組大鼠LVEF、LVFS、LVSD和LVEDD水平隨燧心膠囊劑量增加而變化，但纈沙坦組作用最顯著(P<0.05)。見表1。

表1 燧心膠囊對HF大鼠心功能的影響

2.2 燧心膠囊對HF大鼠心肌纖維化的影響 在Masson染色中，心肌細胞染色為暗紅色，膠原蛋白被染色為藍色；對照組大鼠心肌細胞排列整齊、結構清晰；模型組組大鼠心肌細胞排列不規則、細胞肥大、細胞間出現大量的纖維組織；各燧心膠囊劑量組和纈沙坦組大鼠心肌細胞排列尚整齊，細胞輕度肥大，伴有不同程度的纖維組織增生，較模型組明顯減輕，其中纈沙坦組大鼠改善最為顯著。見圖1。

圖1 燧心膠囊對HF大鼠心肌纖維化的影響(Masson染色，×400)

2.3 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中ROS、GSH和SOD水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠ROS水平升高，GSH和SOD水平降低(P<0.05)；與模型組比較，各燧心膠囊組和纈沙坦組大鼠ROS水平降低，GSH和SOD水平升高，各燧心膠囊組大鼠ROS、GSH和SOD水平隨燧心膠囊劑量增加而變化，但纈沙坦組作用最顯著(P<0.05)。見表2。

表2 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中ROS、GSH和SOD水平的影響

2.4 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平降低(P<0.05)；與模型組比較，各燧心膠囊組和纈沙坦組大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平升高，各燧心膠囊組大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平隨燧心膠囊劑量增加而變化，但纈沙坦組作用最顯著(P<0.05)。見表3。

表3 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影響

圖2 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影響

3 討論

現代中醫認為HF的病機主要是本虛標實，其中本虛以心氣虛、心腎陽虛為主。溫陽法是HF的常用治法，中醫學的“引火歸元”理論具有較重要的指導意義，引火歸元在溫振心陽的同時，增強了腎臟對上炎之火的收納，使君火相火上下相濟，從而達到溫陽而不礙邪的理想狀態[11]。燧心膠囊以溫腎助陽、引火歸元、化氣行水為治則。方中以制附子為君，既補心火，又助腎陽；紅參大補元氣，復脈固脫，益氣安神；熟地黃補腎水，麥冬滋肺陰，金水相生，水火既濟，各安本位。再以茯苓、白術、澤瀉導水趨下，使“妄火”隨之下行，歸于腎水；又佐以丹參活血養血，化瘀通絡，祛除痰濁、瘀血等病理產物，且能調暢氣機，從而達到“陰平陽秘”的平衡狀態[12]。本研究結果顯示，燧心膠囊能改善HF大鼠心功能，證實了上述中醫理論。纖維化可能在舒張功能障礙和收縮泵功能方面發揮重要作用，是致死性心律失常的結構基質之一，從而在HF的進展和猝死中發揮重要作用[13]。研究證明，心肌纖維化的減少與高血壓患者接受不同抗高血壓藥物(如纈沙坦)長期治療時左室功能參數的改善有關[14]。本研究結果顯示，纈沙坦能抑制減少HF大鼠心肌纖維化的產生，燧心膠囊也有類似作用，雖然其作用不如纈沙坦，但纈沙坦只能維持HF的穩態。因此，研究燧心膠囊治療HF具有重要意義。

HF可導致心肌組織氧化應激和能量代謝紊亂，誘導線粒體功能障礙，增加ROS的產生，進而導致心肌氧化應激損傷，凋亡或壞死[15]。ROS的生理濃度對于維持基礎細胞的活動至關重要，但過量產生的ROS可導致氧化應激的誘導。阿霉素會導致氧化應激和心臟結構改變，最終導致心肌損害。阿霉素增加了心臟組織對ROS的敏感性，同時降低抗氧化劑如谷胱甘肽過氧化物酶、GSH和SOD活性[16]。具有抗氧化活性的各種天然產物已被證明可恢復HF大鼠中這些抗氧化劑的功能。燧心膠囊的配方中有多種物質具有抗氧化活性，在心肌梗死引起的心肌損傷過程中發揮心臟保護作用，降低丙二醛含量和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的表達，并增強SOD活性，從而抵抗氧化應激[17]。本研究結果顯示，燧心膠囊組能降低HF大鼠心臟中ROS水平，同時增加GSH和SOD水平，發揮一定的抗氧化活性。此外，燧心膠囊通過激活AMPK/Nrf2通路，發揮抗纖維化作用。然而，目前尚無直接的研究表明心肌系統中AMPK/Nrf2通路參與HF大鼠心肌纖維化調控，這正是本研究的創新性。

AMPK/Nrf2通路是一條公認的氧化應激途徑。AMPK刺激上調了線粒體的生物發生，增加ATP生成，從而調節細胞能量含量，這對于抑制阿霉素引發的氧化應激是必要的。AMPK抑制加重了壓力超載誘導的阿霉素喂養大鼠左心室肥厚[18]。在果糖飲食誘導的2型糖尿病中，氧化應激會觸發AMPK磷酸化，從而刺激Nrf2及其下游抗氧化酶(包括HO-1)，給予AMPK抑制劑可抑制AMPK磷酸化，而且可以降低糖尿病心肌中Nrf2和HO-1的表達[19]。此外，AMPK刺激通過調節線粒體貯存和Nrf2通路，對產前應激誘發的認知缺陷的神經保護作用[20]。Nrf2也被認為與炎癥小體的刺激有關，通過誘導線粒體生物發生，Nrf2的激活保護心肌細胞免受阿霉素誘導的心肌病[21]。同時，Nrf2會激活HO-1信號來保持復合體Ⅰ，復合體Ⅳ活性和線粒體膜電位，從而減少腦缺血再灌注引起的線粒體氧化損傷[22]。此外，Nrf2還通過抑制炎癥介質的轉錄來阻斷炎癥反應，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3炎癥小體的激活需要通過抑制Nrf2表達，本研究將在后續的研究中進行完善[23]。

綜上所述，燧心膠囊可通過降低心臟氧化應激水平及激活AMPK/Nrf2通路，抑制HF大鼠心肌纖維化，為燧心膠囊治療HF纖維化提供了理論依據。